使用氨基酸稳定的依那西普制剂

摘要

本发明提供使用氨基酸稳定且适合依那西普长期储存的稳定水性依那西普药物组合物、制造这些组合物的方法、给药方法和含有其的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及用于依那西普的长期储存的使用氨基酸稳定的水性药物组合物，制造所述组合物的方法，其给药方法和含有其的试剂盒。本发明包括不需要精氨酸用于稳定的依那西普制剂。

背景技术

多肽在其使用之前通常必须被储存。当被储存一段时期时，多肽在溶液中通常不稳定(Manning等人，1989，Pharm.Res.6:903-918)。为延长其保质期，已经开发了另外的处理步骤，诸如干燥，如冷冻干燥。然而，冻干的药物组合物较不方便使用。

为改善多肽稳定性的典型实践可通过改变所述制剂元素的浓度，或通过添加赋形剂以改性所述制剂来解决(参见，例如，美国专利第5580856和6171586号)。然而，添加剂的使用仍然可导致失活的多肽。另外，在冷冻干燥的情况下，再水化步骤可通过，例如，聚集或变性导致所述多肽的失活(Hora等人，1992，Pharm.Res.，9:33-36；Liu等人,1991,Biotechnol.Bioeng，37：177-184)。多肽的聚集是不期望的，因为其可导致免疫原性(Cleland等人,1993,Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Systems,10:307-377；和Robbins等人，1987，Diabetes，36：838-845)。

用以改善多肽稳定性的另一个途径是使用在特定浓度的L-精氨酸(美国专利第7,648,702号)。

在使用前存储长达两年的一种多肽是依那西普(Immunex公司)，其为由连接至人IgG1的Fc部分的人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分组成的二聚体融合多肽。其由934个氨基酸组成，并具有近150千道尔顿的表观分子量(Physicians Desk Reference，2002，MedicalEconomics公司)。依那西普的Fc组分含有人IgG1的重链恒定结构域2(CH2)，重链恒定结构域3(CH3)和铰链区，但无重链恒定结构域1(CH1)。Fc结构域可含有一个或所有以上描述的结构域。通常在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达系统中通过重组DNA技术来生产依那西普。

本发明提供允许其长期储存的依那西普新型稳定液体制剂。

发明内容

本发明为一种水性药物组合物，其包含依那西普和用以抑制依那西普的不稳定性、聚集、错折叠和/或片段化的稳定剂，其中所述稳定剂包含选自由丝氨酸、脯氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸化合物。

以下讨论中所用的各种技术术语在以下题为“定义”的部分被限定且贯穿本说明书的其余部分。

本发明所述稳定的依那西普制剂引起以至少以下一点为特征的长期储存稳定性：(1)在M₃或T₂或T₄(如本文所定义)的SEC分析为大于约90％的单体含量；小于约3wt％的聚集体含量；以及小于约5wt％的片段3含量；和(2)在M₃或T₂或T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量小于约3wt.％；由HIC色谱图的峰2代表的组分的量为大于80wt％；以及由HIC色谱图的峰3表示的组分的量小于约20wt％。

在一个相关的方面中所述含有脯氨酸、丝氨酸或谷氨酸的制剂引起以至少以下一点为特征的长期储存稳定性：(1)在M₃或T₂或T₄的SEC分析为大于约90wt％的单体含量；小于约3wt％的聚集体含量；和小于约5wt％的片段3；和(2)在M₃或T₂或T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量小于约3wt％；由HIC色谱图的峰2代表的组分的量为大于80wt％；以及由HIC色谱图的峰3表示的组分的量小于约20wt％。

在所述稳定制剂的优选方面，所述制剂引起以以下为特征的长期储存稳定性：在M₃或T₂或T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰2代表的组分的量为大于或等于约95wt％；且其中，如果峰3存在于所述HIC色谱图，由峰3代表的组分的量小于或等于约1wt％。

如以上概括的稳定的依那西普制剂，任选地并优选地，不含精氨酸，或基本不含精氨酸。

本发明所述制剂具有优异稳定性，如在5℃下存储一、二或三个月后进行的SEC(排阻色谱)和HIC(疏水作用色谱)分析所测定。这些制剂堪比或优于其中精氨酸为必需组分的市售依那西普制剂。因此本发明还涉及用丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定的依那西普的制剂，其不含精氨酸或基本不含精氨酸，且其中所述组合物在M₃或T₂或T₄引起满足以下标准之一或两者的长期储存稳定性：(A)堪比或优于在商标下销售的市售依那西普的稳定性，这通过(i)在所述组合物(如本说明书中所定义)中的聚集体、单体和片段3的量的SEC分析，和(ii)对应HIC色谱图(如本说明书所定义)的峰1、2和3的所述组合物的中材料的量的HIC分析来测定；和(B)其中(i)峰3不存在或基本不存在和(ii)峰2代表多于约95wt％组合物的HIC色谱图；基本没有对应于聚集体的峰的SEC色谱图；和其中单体含量代表至少约95wt％所述组合物的SEC色谱图。

在其中所述稳定剂为谷氨酸的本发明的实施方案中，所述稳定的制剂包含约25至约75mg/ml的依那西普；多至约150mM的谷氨酸；少于约6wt％的蔗糖；任选地多至约100mM的NaCl；约1至约30mM的磷酸钠，其中所述组合物具有约6.0至6.6的pH，且其中，任选地且优选地，所述组合物不含精氨酸或基本不含精氨酸。

谷氨酸稳定制剂的另一实施方案包含约50mg/ml的依那西普；少于约150mM的谷氨酸；约0至3％的蔗糖；约1至30mM磷酸盐缓冲剂，任选地多至约100mM的NaCl，且具有约6.0至6.6的pH。

另一谷氨酸稳定制剂包含约50mg/ml的依那西普；约100至约120mM的谷氨酸；少于约4wt％的蔗糖，和约10-30，优选约25mM的磷酸盐，并具有约6.3至6.5的pH。

另一谷氨酸稳定制剂包含约50mg/ml的依那西普；约100mM的谷氨酸；少于约2wt％的蔗糖，约100mM的NaCl；约10-30，优选约25mM的磷酸盐；并具有约6.3至6.5的pH。

本发明的又一谷氨酸稳定制剂包含约50mg/ml的依那西普；约50mM的谷氨酸；少于约2wt％的蔗糖，约100mM的NaCl；约10-30优选约25mM的磷酸盐；并具有约6.3至6.5的pH。

在其中所述稳定剂为丝氨酸的又一实施方案中，所述稳定的依那西普组合物包含多至约150mM的丝氨酸；约0.5至约3wt％的蔗糖；约1至约30mM的磷酸钠，且其中所述组合物具有约6.0至6.6的pH；并且其中任选地且优选地不含精氨酸或基本上不含精氨酸。

丝氨酸稳定的依那西普组合物的另一个实施方案包含约50mg/ml的依那西普；约100-120mM丝氨酸；约1wt％的蔗糖，和约10-30，优选约25mM的磷酸盐，并具有约6.3至6.5的pH。

在其中稳定剂为脯氨酸的另一个实施方案中，所述脯氨酸稳定的依那西普组合物包含多至约150mM的脯氨酸；约0.5至约3wt％的蔗糖；约1至约30mM的磷酸钠，约15至约100mM的NaCl；且其中所述组合物具有约6.0至6.6的pH；并且其中任选地且优选地，所述组合物不含精氨酸或基本上不含精氨酸。

本发明所述脯氨酸稳定的依那西普组合物的另一个实施方案含约50mM的脯氨酸，少于约4wt％的蔗糖，约25mM的NaCl，约10-30，优选约25mM的磷酸盐，并且具有约6.3至6.5的pH。

本发明所述依那西普组合物进一步给予提供含有可接受水平的显微镜下可见颗粒的制剂的能力。因此，本发明还涉及丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定的依那西普制剂，其在M₃或T₂或T₄每ml平均具有不多于约10000个尺寸大于5μm的显微镜下可见颗粒。显微镜下可见颗粒可以使用FlowCam分析的已知的方式来测量。

本发明所述的稳定的依那西普组合物进一步以以下为特征：(a)在M₃或T₂或T₄的SEC分析为大于约90wt％的单体含量；和小于约3wt％的聚集体含量的；和(b)在M₃或T₂或T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量小于约3wt％；由HIC色谱图峰2代表的组分的量为大于80wt％；以及由HIC色谱图的峰3代表的组分的量小于约20wt％。

所述制剂的稳定性可进一步以该组合物表现以下在M₃或T₂或T₄的HIC分析为特征：其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量小于约1％；由HIC色谱图的峰2代表的组分的量为大于约95wt％；且由HIC色谱图的峰3代表的组分的量小于约3wt％。

在其中所述稳定剂是谷氨酸的另一个实施方案中，所述依那西普制剂的稳定性可以以以下为特征：在M₃或T₂或T₄的SEC分析为大于约97wt％的单体含量和小于约1wt％聚集体含量的；和在M₃或T₂或T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量小于约3wt％；由HIC色谱图的峰2代表的组分的量为大于约82wt％；以及由HIC色谱图的峰3代表的组分的量小于约15wt％。这些特征在不需要精氨酸作为稳定剂时是可实现的。

在其中所述稳定剂是丝氨酸的另一个实施方案中，所述稳定的依那西普制剂以以下为特征：在M₃或T₂或T₄的SEC分析为大于约97wt％的单体含量和小于约1wt％的聚集体含量的；在M₃或T₂或T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量为小于约4wt％；由HIC色谱图的峰2代表的组分的量为大于约82wt％；且由HIC色谱图的峰3代表的组分的量小于约15wt％。这些特性无需使用精氨酸作为稳定剂即可实现。

本发明优选的稳定的组合物表现出以下在M₃或T₂或T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量小于约2％，优选地小于约1％；由HIC色谱图的峰2表示的组分的量大于约95wt％，优选大于约97％；且由HIC色谱图的峰3代表的组分的量小于约1wt％，优选0至1％。这些特性无需使用精氨酸作为稳定剂即可实现。

不同于以含精氨酸的制剂形式提供的市售依那西普，我们出乎意料的发现，鉴于美国专利第7648702号，本文所描述和示例的依那西普的制剂实施方案不需要精氨酸用于长期稳定，尽管如果需要仍然可以加入精氨酸。提供不使用精氨酸稳定的依那西普制剂的能力，通过提供患者和医疗提供者与需要精氨酸用以稳定的目前商业依那西普制剂(即，)相比较可在较低成本获得的储存稳定的依那西普替代制剂，表现出对于医疗系统的潜在显著利益。

如本文所用的术语“不稳定性”或类似术语表示依那西普单体在储存中进行各种不期望的转化的趋势。此种转化包括低聚物和高分子量聚集体(下文术语“聚集体”)的形成，其中多个基本完整的依那西普单体通过各种非共价键吸引(例如，静电相互作用)互相不可逆结合。在储存中不期望的转化还可包括所述依那西普单体降解成更小的片段和/或断开的形式。理想地，依那西普的制剂应尽可能最小化所述制剂在储存中导致依那西普的聚集体、错折叠蛋白、低聚物和/或片段形成的趋势。减少不需要的聚集体或片段形成的能力带来的重要利益为所述药物潜在毒性和/或免疫原性的减小。

本发明所述的依那西普制剂，其任选地且优选地不含或基本上不含精氨酸。所述术语“基本上不含精氨酸”意在指精氨酸，即使存在，也不有助于所述制剂中依那西普单体的稳定至如此程度以致本领域技术人员会判断其存在从稳定的角度而言是有利或必要的。

这些和其它方面将从以下描述中变得明显，尽管在不背离本公开内容的新概念的精神和范围的情况下可进行其中的变化和修饰。

应当理解的是前述通用描述和以下具体描述仅为示例性和解释性的且并不限制要求保护的本发明。

发明详述

现详细描述本发明的各种实施方案。如说明书所用并贯穿权利要求，“一个(a)”，“一个(an)”，和“所述(the)”的含义包括复数引用，除非上下文中清楚地另有指示。同样，如说明书所用并贯穿权利要求，“在……之中(in)”的含义包括“在……之中(in)”和“在……之上(on)”，除非上下文清楚地另有指示。另外，此说明书中所用的一些术语在以下更具体地定义。

定义

在此说明书中所用的术语通常在本发明的上下文之内，以及使用各个术语的特定上下文中具有其领域内的普通含义。用来描述本发明的特定术语在下文或者在说明书的其它地方进行讨论，以向从业者提供关于本发明的描述的另外指导。提供了特定术语的同义词。一个或更多同义词的叙述不排除其它同义词的使用。在包括本文所讨论的任意术语的实例的此说明书中任何位置实例的使用仅为说明性的，而绝不限制本发明或任意示例性术语的范围和含义。本发明不限于在本说明书中给出的各种实施方案。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与此发明属于的领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。在冲突的情况下，将以本文件，包括定义为准。

“左右(around)”，“约(about)”或“近似(approximately)”一般意思是给定值或范围的20％以内，10％以内，5，4，3，2或1％以内。给定的数量是近似的，意味着所述术语“左右(around)”，“约(about)”或“近似(approximately)”如果未明确陈述可进行推断。

所述术语“依那西普”或“依那西普单体”或“单体”与同义。其指一种多肽，是由连接至人IgG1的Fc部分的人75千道尔顿(p75)的肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分组成的二聚融合多肽。其由934个氨基酸组成，并具有近150千道尔顿的表观分子量。出于本申请的目的，所述术语“依那西普”还包含具有没有显著影响依那西普的功能、效力、或亲合力的在氨基酸结构中的较小修改(包括氨基酸的缺失，添加和/或取代)的依那西普。所述术语“依那西普”包含的的所有形式和制剂，包括但不限于浓缩制剂，可注射的即用制剂；与水、醇、和/或其它成分重新组成的制剂，以及其它。

本文所用的术语“单体”旨在表示以上引用的二聚依那西普融合蛋白。

所述术语“丝氨酸”指其密码子为UCU、UCC、UCA、UCG、AGU、和AGC的氨基酸。

所述术语“脯氨酸”指其密码子为CCU、CCC、CCA和CCG的α-氨基酸。

所述术语“谷氨酸”指α-氨基酸谷氨酸(Glu)的去质子化形式或盐。出于本申请的目的，所述术语“谷氨酸”还包含谷氨酸本身。

所述术语“糖”指单糖、二糖和多糖。糖的实例包括但不限于蔗糖、海藻糖、右旋糖及其它。

所述术语“多元醇”指含有多个羟基基团的醇。多元醇的实例包括但不限于甘露醇、山梨醇及其它。

所述术语“长期储存”应理解为意味着所述药物组合物可储存三个月或更长，六个月或更长，以及优选地一年或更长。长期储存还应理解为意味着所述药物组合物作为液体在2-8℃储存，或者例如在-20℃或更低温冻结。还可想到所述组合物可被冻结和解冻多于一次。

关于长期储存所述术语“稳定(stable)”或“稳定的(stabilized)”应理解为意味着所述药物组合物中含有的依那西普相对在储存开始所述组合物的活性，不损失其活性多于20％，或更优选地15％，或甚至更优选10％，以及最优选5％。

所述术语“哺乳动物”包括但不限于人类。

所述术语“药学上可接受的载体”指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、制剂辅助剂或任意常规类型的赋形剂。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，且与所述制剂的其他成分相容。

所述术语“组合物”指通常含有载体，诸如本领域内常规且适合进入受试者内给予用于治疗、诊断或预防目的药学上可接受载体或赋形剂的混合物。其可包括细胞培养，其中所述多肽或多核苷酸存在于所述细胞内或所述培养基内。例如，用于口服给予的组合物可形成溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂、口腔冲洗剂或粉末剂。

所述术语“药物组合物”和“制剂”可交换使用。

所述术语“治疗”指用于哺乳动物中疾病的治疗药的任意给予或应用，并包括抑制所述疾病、控制其发展、减轻所述疾病，例如通过引起消退，或恢复或修复损失、缺失或缺陷功能；或刺激低效率过程。所述术语包括获得期望的药学的和/或生理学的效果，覆盖哺乳动物中病理学病况或不适的任意治疗。所述效果，在完全或部分预防不适或其症状方面可为预防性的，和/或在部分或完全治疗不适和/或归因于所述不适的不良影响方面可为治疗性的。其包括：(1)在对所述不适有倾向但尚未有症状的受试者中预防所述不适发生或复发，(2)抑制所述不适诸如控制其发展，(3)停止或终止所述疾病或至少其相关症状，以使得所述宿主不在遭受所述不适或其症状，诸如引起所述不适或其病症的消退，例如，通过恢复或修复损失、缺失或缺陷功能，或刺激低效率过程，或者(4)减轻、缓和或改善所述不适或与其相关的症状，其中改善用于广义以指至少一个参数诸如炎症、疼痛和/或肿瘤尺寸量级的减小。

所述术语“疾病”指需要医药介入或对于其医药介入是期望的任意病况、感染、不适或症状。这种医药介入可包括治疗、诊断和/或预防。

所述术语“治疗上有效量”指当向活体受试者给予时在所述活体受试者上达到期望效果的量。例如，用于向活体受试者给予的治疗有效量的本发明所述多肽为预防和/或治疗整合素αvβ3-介导疾病的量。该确切量将取决于所述治疗的目的，且由本领域技术人员使用已知技术将可确定。如本领域内已知，对系统相对局部递送、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、给予时间、药物相互作用和所述病况的严重程度的调节是必须的，且由本领域技术人员使用常规实验可确定。

所述术语“T₁”指依那西普制剂已在40℃被储存约一周的时间点。

所述术语“T₂”指依那西普制剂已在40℃被储存约两周的时间点。

所述术语“T₄”指依那西普制剂已在40℃被储存约四周的时间点。

所述术语“M₃”总共指三个时间点，具体指对依那西普制剂在5℃的存储温度下在约一个、约两个或约三个月的储存时间后观察到的分析结果。例如，本文对在M₃进行的分析的引用应理解为意味着这种分析在依那西普制剂已被储存选自约一个、约两个或约三个月的时间的时间点进行。因此，如果在对应至少一个以下储存持续时间：在5℃储存近似一个月、近似两个月或近似三个月的的时间点观察到所需值，则满足本文的要求即在M₃依那西普制剂引起特定分析值或测量值。

所述术语“峰1”、“峰2”和“峰3”当在本文中结合HIC色谱结果的讨论使用时，指在美国专利7,294,481中所讨论的相同的峰1、2和3。

具体实施方式

当含有依那西普包括依那西普的水性和冻干制剂的药物组合物被长期储存时，依那西普的活性可能会因所述依那西普单体通过聚集和/或化学降解包括片段形成的不稳定而丢失或减少。因此，本发明提供了允许依那西普稳定长期储存的依那西普的水性制剂的几个实施方案，使得依那西普，不管以液体还是冻结状态，在存储的过程中均是稳定的。所提供的制剂包括但不限于不含精氨酸且不需要任何额外步骤诸如再水化的制剂。

以下更详细地解释这些实施方案。

依那西普

本发明的所有组合物均包含依那西普如本申请的背景部分所解释，依那西普为由连接至人IgG1的Fc部分的人75千道尔顿(p75)肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分组成的二聚体融合多肽。依那西普由934个氨基酸组成。所述依那西普的Fc组分含有人IgG1的重链恒定结构域2(CH2)，重链恒定结构域3(CH3)和铰链区。Fc结构域可含有一个或所有以上描述的结构域。

在发明的本药物组合物中适于储存的依那西普可由表达依那西普的活体宿主细胞诸如抗体情况下的杂交瘤，或在融合多肽或抗体情况下经基因工程以产生多肽的的宿主细胞来生产。基因工程细胞方法以产生多肽为本领域熟知。参见例如，Ausubel等人.,eds.(1990),Current Protocols in Molecular Biology(Wiley,纽约)。这种方法包括将编码且允许所述多肽表达的核苷酸引入活体宿主细胞。这些宿主细胞可为细菌细胞、真菌细胞或优选地培养生长的动物细胞。细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌细胞。合适的大肠杆菌菌株的实例包括：HB101、DH5.alpha、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539和任意不能裂解外来DNA的大肠杆菌菌株。可以使用的真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母和曲霉菌属细胞。可以使用的动物细胞系的一些实例为CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3和W138。新动物细胞系可使用本领域技术人员熟知的方法(例如，通过转化、病毒感染和/或选择)来建立。任选地，依那西普可由所述宿主细胞分泌至培养基。

所表达的依那西普的纯化可通过任意标准方法进行。当细胞内产生依那西普时，该颗粒片段被移除例如通过离心或超滤。当依那西普被分泌入所述培养基时，这种表达系统的上清液可首先使用标准多肽浓缩过滤器进行浓缩。还可加入蛋白酶抑制剂来抑制蛋白水解，且可包括抗生素以预防微生物的生长。

依那西普可使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱、以及已知或有待发现的纯化技术，包括但不限于蛋白A色谱、离子交换柱分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅色谱、肝素色谱法、阴离子或阳离子交换树脂色谱(诸如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀的任意结合来纯化。

使用丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定的依那西普

本发明提供包含依那西普和用以抑制依那西普的不稳定性、聚集、错折叠和/或片段化的稳定剂的稳定水性药物组合物，其中所述稳定剂包含选自由丝氨酸、脯氨酸和谷氨酸组成的组的化合物。在一个优选的实施方案中所述稳定剂包含谷氨酸。

不希望囿于本发明的任何特殊理论，丝氨酸、脯氨酸和谷氨酸被认为作为构象稳定剂以减少依那西普聚集的趋势。所述聚集的减少被认为持续长时间，例如两年或更多。丝氨酸、脯氨酸和谷氨酸被认为能稳定含有依那西普的水性药物组合物因为其从所述蛋白的表面被排除，造成净构象稳定化。丝氨酸、脯氨酸和/或谷氨酸的稳定效果包括但不限于受益于在含有所述单体的制剂中的依那西普单体的减少。

本发明所述的药物组合物可通过结合纯化的依那西普和稳定剂来制备。进一步，可按需加入缓冲剂、张度改性剂和另外的赋形剂和其它通常使用的非活性成分。简单起见，在本说明书中稍后将更全面地讨论这些。本领域普通技术人员将理解所述组合物中要包括的各种组分的结合可以以任意合适的顺序完成。例如，所述缓冲剂可最先、中间或最后加入，以及所述张度改性剂可最先、中间或最后加入。本领域普通技术人员还将理解这些化学品中的一些在某些组合中可不相容，并因此容易使用具有相似性质但在所述相关混合物中相容的不同化学品代替。

在一个优选的实施方案中，在所提供的制剂中所述丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定剂的浓度优选地多至约150mM。

丝氨酸、脯氨酸和谷氨酸可从商业供应商获得。

在其中所述稳定剂包括谷氨酸的实施方案中，本发明的制剂可包含约25至50mg/ml的依那西普；多至150mM的谷氨酸；少于6wt％的蔗糖；任选的多至100mM的NaCl；约1至约30mM的磷酸钠，且其中所述制剂具有pH6.0至约7.0且更优选约6.0至约6.6，且最优选地约6.3至6.5之间。

在其中所述稳定剂包含丝氨酸的实施方案中，本发明的制剂可以包含约25至约50mg/ml的依那西普；少于约150mM的丝氨酸；约0.5至约3wt％的蔗糖；约1至约30mM的磷酸钠，并且其中所述制剂具有约pH6.0至约pH7.0，且更优选约6.0至约6.6，以及最优选约6.3至约6.5之间。

在其中所述稳定剂包含脯氨酸的实施方案中，本发明的制剂可包含约25至约50mg/ml的依那西普；少于约150mM的脯氨酸；约0.5至约3wt％的蔗糖；约1至约30mM磷酸钠，约15至约100mM的NaCl；并且其中所述制剂具有pH6.0至约pH7.0，更优选约6.0至约6.6，和最优选约6.3至约6.5之间。

根据本发明包含丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸的依那西普制剂优选地以以下为特征：在T₂的SEC分析为约80至约95wt％单体含量；少于约4wt％聚集体含量；和少于约8wt％的片段3含量。

本发明含有丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸用于稳定的特定制剂中，所述制剂引起以以下为特征的稳定性：

(a)在T₄的SEC分析为大于约90、91、92、93、94、95、96或97wt％单体含量；和少于约3、2或1wt％的聚集体含量；和

(b)在T₂的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量少于约3、

2或1wt％；由HIC色谱图的峰2代表的组分的量多于80、81、82、83、84或85wt％；以及由HIC色谱图峰3代表的组分的量少于约20、19、18、17、16、15、14、或13wt％；和

(c)在T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量少于约3、2或1wt％；由HIC色谱图峰2代表的组分的量多于80、81、82、83、84或85wt％；以及由HIC色谱图峰3代表的组分的量少于20、19、18、17、16、15、14、或13wt％。

术语“SEC”、“T₂”“、“T₄”、“M₃”、“HIC”单体含量”“聚集体”和“片段3”“峰1”、“峰2”和“峰3”在以下实施例中定义。

在含有丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸用于稳定的特别优选的制剂中，优选地以具有以下在T₄或T₂的HIC分析为特征：其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量少于约1％；由HIC色谱图的峰2代表的组分的量多于约95wt％，且最优选多于约99wt％；且由HIC色谱图的峰3代表的组分的量少于约3wt％。

使用丝氨酸，脯氨酸和/或谷氨酸用于依那西普的稳定的另一优选的制剂包含约50mg/ml的依那西普；少于约150mM的丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸，且最优选为谷氨酸；约0至3％的蔗糖；约1至30mM的磷酸盐缓冲剂，以及具有约6.0至6.6pH；且以以下为特征：在T₄的SEC分析位大于约97wt％的单体含量和小于约1wt％的聚集体含量；在T₂的HIC分析，其中由HIC色谱的峰1代表的组分的量小于约3wt％；由HIC色谱的峰2代表的组分的量为大于约82wt；且由HIC色谱的峰3代表的组分的量小于约15wt％；以及在T₄的HIC分析，其中由HIC色谱的峰1代表的组分的量小于约2wt％；由HIC色谱的峰2代表的组分的量大于约84wt％；以及由HIC色谱的峰3代表的组分的量小于约13wt％。

在本发明的另一个实施方案中，所述稳定的依那西普组合物使用丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定，该制剂不含或基本上不含精氨酸，且该制剂引起以至少以下之一为特征的长期储存稳定性：

在M₃的SEC分析为单体含量大于约90％，聚集体含量小于约3wt％；和片

段3的含量小于约5重量％；和

在M₃的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量小于约3wt％；

由HIC色谱图的峰2代表的组分的量大于80wt％；以及由HIC色谱图的峰3

代表的组分的量小于约20wt％。

优选地本发明所述丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定的组合物引起以以下为特征的长期储存稳定性：在M₃的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰2代表的组分的量大于或等于约95wt％；以及其中如果峰3在所述HIC色谱图是存在，由峰3代表的组分的量小于或等于约1wt％。

在本发明的另一方面，本发明所述丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定的组合物引起以以下为特征的长期储存稳定性：

在M₃或T₄的SEC分析为大于约90wt％的单体含量；少于约3wt％的聚集体

含量；和少于约5wt％的片段3；和

在M₃或T₂或T₄的HIC分析，其中由HIC色谱图的峰1代表的组分的量小

于约3wt％；由HIC色谱图的峰2代表的组分的量大于80wt％；以及由HIC

色谱图的峰3代表的组分的量小于约20wt％。

另一优选的谷氨酸稳定的依那西普制剂包含：约50mg/ml的依那西普；约120mM的谷氨酸；约1％的蔗糖和约25mM的磷酸盐；具有约6.3至约6.5的pH，并表现出上述SEC和HIC分析特征。

优选地，根据本发明所述的稳定的依那西普制剂在5℃或25℃储存一个、两个或三个月后(a)以其中峰3基本不存在的HIC色谱图为特征；(b)以不含有或基本无对应聚集体的峰的SEC色谱图为特征；和(c)以其中所述单体含量代表至少约97wt％的所述组合物的SEC色谱图为特征。

所述不含精氨酸的丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定的依那西普制剂，被发现引起在5℃存储三个月的稳定性，其堪比或优于目前可获得的含精氨酸市售Enbrel制剂。因此本发明还涉及丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定的依那西普制剂，其不含精氨酸或基本不含精氨酸，且其中所述组合物在M₃或T₂或T₄引起满足以下标准之一或两者的长期储存稳定性：

(A)堪比或优于在商标下销售的市售依那西普的稳定性，其通过以下测量：(i)在所述组合物(如本说明书中所定义)中的聚集体、单体和片段3的量的SEC分析，和(ii)对应HIC色谱图(如本说明书所定义)的峰1、2和3的所述组合物中材料的量的HIC分析；和

(B)其中(i)峰3不存在或基本不存在且(ii)峰2代表多于约95wt％的所述组合物的HIC色谱图；基本上没有对应于聚集体的峰的SEC色谱图；和其中单体含量代表至少约95wt％的所述组合物的SEC色谱图。

尽管本发明不排除精氨酸的使用，根据本发明包含丝氨酸、脯氨酸和/或谷氨酸用于稳定的依那西普制剂不需要精氨酸用于稳定，且因此优选地不含或基本不含精氨酸。

所提供的药物组合物的其它组分

本发明的制剂还可包括缓冲剂、张度改性剂、赋形剂、药学上可接受的载体和药物组合物通常使用的其它非活性成分。简单起见，在本说明书中稍后将更全面地讨论这些。

缓冲剂保持pH在期望范围内。合适的缓冲剂包括组氨酸、磷酸钾、柠檬酸、马来酸钠或钾、醋酸铵、三-(羟甲基)氨基甲烷(tris)、各种形式的醋酸盐和二乙醇胺。所述制剂中所述缓冲剂的浓度优选地在约1mM至约1M之间，更优选约10mM至约200mM制剂。缓冲剂为本领域熟知的且通过已知方法制造以及可从商业供应商获得。

适合的缓冲剂的实例为磷酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、三-(羟基)-氨基甲烷(tris)、碳酸氢盐。

在一个优选的实施方案中，所述缓冲盐为磷酸钠。

在一个优选的实施方案中，所述药物组合物的pH在或接近生理水平。因此，优选地，所提供的组合物的pH在约5.8至约8.4之间；甚至更优选，在约6.2和约7.4之间。本领域技术人员将理解所述pH可按需调节以最大化在某种制剂中依那西普的稳定性和溶解性。因此，pH在生理范围之外但对于患者尚可容许的依那西普制剂，也在本发明所述的范围之外。

张度改性剂为有助于溶液重量摩尔渗透压浓度的分子。药物组合物的重量摩尔渗透压浓度优选地被调节以最大化所述活性组分的稳定性和/或以最小化给药对患者的不适。通常优选的是药物组合物与血清等渗，即具有同样或相似的重量摩尔渗透压浓度，其可通过张度改性剂的加入达成。

在一个优选的实施方案中，所提供制剂的重量摩尔渗透压浓度从约180至约420mOsM。然后，应当理解的是，按照具体情况要求，所述重量摩尔渗透压浓度可更高或更低。

适用于修饰重量摩尔渗透压浓度的张度改性剂的实例包括但不限于氨基酸(不包括精氨酸)(例如半胱氨酸、组氨酸和甘氨酸)、盐(例如，氯化钠、氯化钾和柠檬酸钠)和/或糖类(例如，蔗糖、葡萄糖和甘露醇)。

优选的张度改性剂为甘氨酸、丙氨酸、氯化钠、氯化钾和硫酸钠。

在一个优选的实施方案中，所述制剂中所述张度改性剂的浓度优选地在约1mM至约1M之间，更优选地约10mM至约200mM。张度改性剂为本领域熟知的且可通过已知方法制造和可从商业供应商获得。

赋形剂，还被称为化学添加剂、共溶质或共溶剂，其当在溶液(以及在干燥或冻结形式)中时稳定所述多肽，也可被添加至药物组合物。赋形剂为本领域熟知且可通过已知方法制造和可从商业供应商获得。

适合的赋形剂的实例包括但不限于糖/多醇诸如：蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖；聚合物诸如：血清白蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、人SA或重组HA)、葡聚糖，聚(乙烯基醇)，PVA、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)；非水性溶剂诸如：多元醇，(例如，PEG和甘油)和二甲基甲酰胺(DMF)；氨基酸诸如：脯氨酸、L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸和γ-氨基丁酸；表面活性剂诸如：-80(聚山梨醇酯80)、-20(聚山梨醇酯20)、SDS、聚山梨醇酯、泊洛沙姆；以及各种赋形剂诸如：磷酸钾、醋酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、金属离子(如锌、钙、和镁)、CHAPS、单月桂酸酯、2-O-β-甘露糖甘油酯或上述的任意组合。

优选的赋形剂为蔗糖、乳糖、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇，麦芽糖、肌醇、海藻糖、葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、重组白蛋白、葡聚糖、PVA、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、聚乙烯亚胺、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基纤维素(HEC)、聚乙二醇、乙二醇、甘油、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、SDS、聚山梨醇酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188、三甲胺N-氧化物、甜菜碱、锌离子、钙离子、镁离子、CHAPS，蔗糖单月桂酸酯和2-O-β-甘露糖甘油酯。

本发明的制剂中一种或更多赋形剂的浓度优选地在约0.001至5重量百分数之间，更优选地约0.1至2重量百分数。

治疗方法

在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物给予治疗有效量的本发明所述的药物组合物，其中所述哺乳动物具有使用依那西普可有益地治疗的疾病或不适。

在一个优选的实施方案中，所述依那西普源自与将用所述组合物治疗的相同种类的哺乳动物。

在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物为人类。

可用所提供的组合物治疗的疾病或不适包括但不限于类风湿关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊椎炎、韦格纳氏病(肉芽肿病)、克罗恩病(或炎症性肠疾病)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、丙型肝炎、子宫内膜异位、哮喘、恶病质、银屑癣和特应性皮炎。可用本发明所述组合物治疗的其它疾病或不适包括在WO00/62790、WO 01/62272、美国专利申请第2001/0021380号和美国专利7,648,702B2中所描述的那些，其相关部分通过引用的方式并入本文。

所提供的药物组合物可通过系统注射，诸如静脉注射；或通过向相关位点的注射或施用，诸如当该位点暴露于手术时通过直接注射或直接施用至所述位点；或通过局部施用向需要治疗的受试者给药。

在一个实施方案中，本发明提供治疗和/或预防风湿性关节炎的方法，包含向需要其的哺乳动物给予治疗上有效量的所提供的依那西普组合物之一。

在所提供的组合物中所述治疗上有效量的依那西普将取决于要治疗的病况、所述病况的严重程度、先前的治疗、以及患者的临床历史和对所述治疗药剂的应答。适当剂量可根据主治医生的判断进行调节，从而将其一次或经一系列的给药给予患者。

在一个实施方案中，每成人剂量的有效依那西普的量为约1-500mg/m²或约1-200mg/m²，或约1-40mg/m²或约5-25mg/m²。

或者，也可给予固定剂量，其量可为2-500mg/剂量，2-100mg/剂量或约10-80mg/剂量。

如果该剂量将给予每周多于一次，示例性的剂量范围与之前描述的剂量范围相同或更低，且优选地以25-100mg/剂量的每剂量范围给予每周两次或更多次。

在另一个实施方案中，用于注射给药的可接受剂量含有80-100mg/剂量，或者含有80mg每剂量。

该剂量可每周、每两周、或每几周(例如2至8周)给予。

在一个实施方案中，依那西普以25至75mg/ml通过单皮下(SC)注射给予。

在一些实例中，患者病况的改善将通过每周一至三次持续至少三周给予多至约100mg剂量的所述药物组合物来获得。延续更长时期的治疗对引起期望程度的改善可为必要的。对于不能治愈的慢性病况该疗法可无限期继续。对于儿科患者(年龄4-17)，合适的疗法可涉及每周一次或多次给予0.4mg/kg至5mg/kg剂量的依那西普。

在另一个实施方案中，本发明的药物制剂可以以散装制剂制备，且照此，所述药物组合物的组分被调节至高于给药所需并在给药前适当地稀释。

所述药物组合物可作为单一治疗剂或按需与另外的治疗结合给予。因此，在一个实施方案中，所提供的治疗和/或预防方法与给予治疗上有效量的另一活性剂结合使用。所述其它活性剂可在给予本发明所述药物组合物之前、期间或之后给予。另一活性剂可以作为所提供组合物的一部分，或者，作为单独的制剂给药。

所提供的药物组合物的给药可以以各种方式实现，包括肠胃外经口、口腔、舌下、鼻、直肠、腹膜内、皮内、透皮、皮下、静脉内、动脉内、心内、心室内、颅内、气管内，鞘内给予，肌肉注射，玻璃体内注射和局部应用。

本发明所述的药物组合物尤其用于胃肠外给药，即皮下、肌内、静脉内、腹膜内、脑脊髓内、关节内，滑膜内，玻璃体内，和/或鞘内。胃肠外给药可通过弹丸注射或持续输注。用于注射的药物组合物可以以单位剂量的形式存在，例如，在安瓿瓶中或在多剂量容器中，连同所添加的防腐剂。另外，已发展许多最新的药物递送方法，且本发明所述的药物组合物适合使用这些新方法给药，例如注射器笔诸如和无针器械诸如和本药物组合物还可适合于尚待发现的给药方法。也参见Langer,1990,Science,249:1527-1533。

所提供的药物组合物还可制成贮库制剂。这种长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此，例如，所述制剂可使用适合的聚集或疏水材料(例如作为溶于可接受的油的乳剂)或离子交换树脂修饰，或成为难溶衍生物，例如作为难溶性盐。

若需要，所述药物组合物可存在于可含有一个或更多含有所述活性成分的单位剂量形式的小瓶、包装或分散器械中。在一个实施方案中，所述分散器械可包含具有单次剂量即用液体制剂的注射器。所述注射器可随附给药说明。

在另一个实施方案中，本发明涉及试剂盒或容器，其含有本发明的水性药物组合物。在所述水性药物组合物中所述多肽的浓度可在一个宽的范围内变化，但通常在从约0.05至约20000微克每毫升(μg/ml)水性制剂的范围内。所述试剂盒还可随附使用说明。

本发明更特别地描述于以下实施例，其意在说明，因为其中许多改进和变化对本领域技术人员将是明显的。

实施例1

使用丝氨酸稳定的依那西普

使用丝氨酸、脯氨酸或谷氨酸稳定的依那西普制剂可使用以下程序制备：

称量各个固体制剂组分至给定体积的制剂缓冲剂所需的量。这些组分被合并入能够装载和测量所述给定体积的制剂缓冲剂的烧杯或容器。相当于近似3/4所述目的给定制剂缓冲剂的近似3/4体积的去离子水被加入所述烧杯，随后将所述组分溶解。所述缓冲剂的pH被使用1M氢氧化钠或1M盐酸调节至目的制剂的pH。然后通过加入去离子水使最终的制剂缓冲剂体积上升至所述目的体积。依那西普蛋白质溶液放置于透析材料袋(诸如Thermo Scientific Slide-A-Lyzer MINIDialysis Unit10,000MWCO)中，其随后与所需的制剂缓冲剂在4℃接触放置12小时。制剂缓冲体积与蛋白溶液体积的比应不小于1000:1。所述透析袋和其含有的蛋白溶液随后在第二份同样体积的制剂缓冲剂中在4℃放置另外12小时。将所得到的蛋白溶液从所述透析材料袋中移出，且所述蛋白的浓度使用紫外线光谱测定。使用离心(诸如Amicon Ultra10,000MWCO离心浓缩机)和/或用制剂缓冲剂稀释将蛋白浓度调节至期望水平。

可通过排阻色谱(SEC)、变性SEC(dSEC)、疏水作用色谱(HIC)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对所述组合物测试长期稳定性，以及在不同时间点的结合和生物活性。所述生物活性可通过任意数量的熟知试验测量。

例如，排阻色谱技术描述于Hawe等人，Pharm.Res.2011,28:2302和/或vanMarrschalkerweerd等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.2011,78:213。相似地，变性排阻色谱、疏水作用色谱和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对于本领域普通技术人员也是熟知的。

所述组合物被认为在两年或更长的时期将是稳定的。

(制剂1:15)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml丝氨酸(非活性成分)25mM磷酸钠，pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)1％(w/v)NaCl(非活性)100mM

(制剂1:12)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml丝氨酸(非活性成分)25mM磷酸钠,pH6.4(非活性)25mM蔗糖(非活性)2.5％(w/v)或5％(w/v)NaCl(非活性)100mM

(制剂1:16)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml丝氨酸(非活性成分)50mM

磷酸钠,pH6.4(非活性)25mM蔗糖(非活性)5％(w/v)NaCl(非活性)25mM

(制剂2:4)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml丝氨酸(非活性成分)100mM磷酸钠,pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)1％(w/v)

(制剂3:8)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml丝氨酸(非活性成分)120mM磷酸钠,pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)1％(w/v)

实施例2

使用脯氨酸稳定的依那西普

(制剂1:4)

成分浓度

依那西普(活性成分)50mg/ml脯氨酸(非活性成分)25mM磷酸钠,pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)2.5％(w/v)NaCl(非活性)50mM

(制剂1:5)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml脯氨酸(非活性成分)50mM磷酸钠,pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)1.0％(w/v)NaCl(非活性)25mM

(制剂1:6)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml脯氨酸(非活性成分)100mM磷酸钠,pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)1.0％(w/v)

实施例3

使用谷氨酸稳定的依那西普

使用谷氨酸稳定的组合物可使用与实施例1中所描述的那些相似的程序进行制备和测试。

谷氨酸稳定的依那西普组合物，不含有精氨酸，如以下示例：

(制剂1:9)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml谷氨酸(非活性成分)25mM磷酸钠,pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)1％(w/v)NaCl(非活性)100mM

(制剂2:2)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml谷氨酸(非活性成分)50mM磷酸钠,pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)1％(w/v)NaCl(非活性)50mM

(制剂2:3)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml谷氨酸(非活性成分)100mM磷酸钠,pH6.3(非活性)25mM蔗糖(非活性)1％(w/v)

(制剂3:5)

成分浓度依那西普(活性成分)50mg/ml谷氨酸(非活性成分)120mM磷酸钠,pH6.5(非活性)25mM蔗糖(非活性)1％(w/v)

可测试所述组合物的长期稳定性，且该生物活性可以以如实施例1中讨论的同样的方式测量。

所述组合物被认为在两年或更长时期将是稳定的。

实施例4

依那西普的制备

步骤1：细胞扩增。在本领域内已知的方式中，使用表达依那西普融合蛋白的CHO细胞克隆进行对生成对于生产生物反应器的接种足够的有效数目的细胞必需的细胞扩增。此表达过程的产物(所收获的细胞培养液)是正确折叠的依那西普以及不正确折叠和/或聚集的依那西普连同另外的杂质的混合物。将包含这种蛋白混合物的所收获的细胞培养液进行洗涤剂病毒灭活。

步骤2：亲和色谱。对于在以上步骤1中所收获的细胞培养液以熟知的方式使用常规蛋白A亲和柱进行亲和色谱。产物回收率为近似85％。所获得的产物为包含正确折叠依那西普、不正确折叠依那西普和/或正确和/或不正确折叠依那西普的聚集体、或蛋白片段的复合蛋白混合物。从此蛋白A亲和柱纯化步骤获得的产物被调节至pH3.5然后进行病毒灭活步骤。病毒灭活后将该产物调节至pH5.5并以已知方式使用商业获得的囊式过滤器的进一步净化。

步骤3A。混合模式阳离子交换色谱。使用31.8L(45cm直径×20cm床高度)的填充床GE Healthcare Capto MMC色谱柱来纯化在上述步骤2中获得的产物。在使用前，所述柱子使用2CVpH5.5的25mM醋酸盐平衡且用2CV的0.1NNaOH、1M NaCl消毒，并用2CVpH5.5的25mM醋酸盐、0.7M NaCl中和。然后使用8-10CVpH5.5的25mM醋酸盐平衡所述柱子直到流出物为pH5.5且3.5mS/cm。将来自以上步骤2的蛋白A集液(pool)使用WFI稀释至≤6mS/cm并施加至每个循环多至15g/L媒介的柱负载。所述柱子在200cm/h的线性速度下操作以给出6分钟滞留时间。装载后，所述柱子使用2CV pH5.5的25mM醋酸盐洗涤。随后用8.5CV,15％至85％梯度的25mM pH5.5的醋酸盐至25mM醋酸盐，0.7M NaCl，pH5.5洗脱产物。产物收集始于0.15OD(A280,1.0cm路径长度)且收集止于50％最大峰值。洗脱液体积近似5CV。使用2CV pH8.0的10Mm的Tris、1M NaCl从所述柱子脱除剩余的产物和污染物并丢弃。从该混合模式柱子获得的产物使用Millipore Opticap XL10,0.22μm Durapore囊式过滤器(0.69m²)进行过滤。从此步骤获得的产物表现出约70％在的步骤2中获得的蛋白A材料的回收率。

步骤3B。混合模式阴离子交换色谱。使用27.0L(45cm直径×17cm床高度)的填充床GE Healthcare Capto Adhere色谱柱以进一步纯化在以上步骤3A中获得的产物。使用前，使用2CV pH8.0的25mM Tris平衡所述柱子，以及使用2CV的0.1N NaOH、1M NaCl消毒并使用2CV pH8.0的25mM Tris中和和平衡。产物装载前，使用3CV pH8.0的10mM Tris平衡所述柱子。来自以上步骤3A的Capto MMC集液使用每Kg集液～0.045kg的1M Tris(pH8.3)调节至pH8.1。将来自以上步骤3A中的产物使用WFI进行连续1:3.8稀释以调节导电率至12.0mS/cm和pH8.0。随后将所获得的材料施加至多至15g/L媒介的柱负载。所述柱子在170cm/h的线性速度下操作以给出6分钟的滞留时间。装载后，使用2CV pH8.0的25mM Tris洗涤该柱子。随后用10CV梯度(20％至90％)的25mM Tris,pH8.0至10mM Tris,1M NaCl,pH8.0洗脱产物。产物收集始于0.15OD(A280,1.0cm路径长度)并且收集止于25％最大峰值。洗脱液体积为4-6CV。所洗脱的产物使用商业可获得的囊式过滤器过滤，随后以已知方式进行病毒灭活和切向流过滤步骤。从步骤3B(包括最终病毒和切向流过滤步骤)的总产物回收为近似68％。在过滤步骤前测量的产物回收率率为约75％。在来自此步骤的洗脱片段上获得的HIC数据的图示示于图12。

分析：在此实施例中获得的最终过滤产物被发现具有由HIC测定的大于约90wt％正确折叠依那西普；由HIC测定的少于5wt％不正确折叠的依那西普形式；由HIC分析测定的少于约3wt％的断开物质(被认为为依那西普片段，其中TNFR部分被截短)，以及由排阻色谱测定的多于95wt％正确和不正确折叠依那西普的合并量。

依那西普制剂分析

A.热稳定性储存

透析和浓缩后，将以上示例的依那西普制剂样品在生物安全柜中无菌过滤。使用无菌的移液管和高压蒸汽处理的移液管尖头，将依那西普制剂样品被转移至预先标签的且高压蒸汽处理的1mL冻干小瓶。小瓶使用无菌的丁基塞塞住并用铝帽夹住。然后所有小瓶被转移至热稳定性烤箱。样品经受两种热稳定性方案：(1)在40℃下两周，和(2)在25℃四周。贯穿此说明书，这两个温度方案分别表示为“T₂”和“T₄”。

B.排阻色谱(SEC)

本文所公开的依那西普制剂使用排阻色谱(SEC)的熟知技术进行，其中分析物按照尺寸分离的高性能液色谱方法进行分析(参见Rogner,M.(2000).SizeExclusion Chromatography.Protein Liquid Chromatography.M.Kastner.Amsterdam,Elsevier.61:89-145)。为了评价以上描述的依那西普样品的热稳定性，通过基于文献(van Maarschalkerweerd,A.,G.J.Wolbink,等人(2011)"Comparison ofanalytical methods to detect instability of etanercept during thermal stress testing."European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics78(2):213-221.)的SEC方法检查所述样品。所述流动相缓冲剂被制备为含有50mM磷酸钠单碱一水合物和150mM精氨酸。使用1M HCl调节pH至6.5。所有分离均使用成线性连接至TosohTSK-Gel G4000SW×l7.8mm×30cm(cat.no.8542)的Tosoh TSK-Gel SW×l6mm×4cm保护柱(cat.no.8543)进行。为进行分离，使所述柱子至室温(23℃)并使用流动相在0.5mL/min的流速下平衡。使用自动进样针将5微升的50mg/mL依那西普制剂注射至所述柱子。该分离在0.5mL/分钟的流速下经30分钟完成。在此期间280nm波长下检测柱洗脱液。

C.排阻色谱色谱图的整合

所有整合使用Chromeleon software(Dionex)进行。整合之前，不含依那西普的缓冲剂的SEC色谱图被从所有色谱图中减去。所有整合在12分钟和26分钟的保留时间之间进行。使用七个参数定义峰。检测峰的最小面积被设置为0.05mAu*min。峰检测的二维敏感度被设置为0.01mAu和75秒。使用手动整合工具手动地添加峰肩。所有被检测峰以两个步骤手动调节。第一，调节峰基线(该峰的底边界)至水平线。第二，调节所述峰基线的垂直位置至色谱图基线的垂直位置。所述色谱图基线至被定义为不存在分析物的信号。不存在分析物的信号被定义为在12分钟保留时间mAu中的吸光度。

D.依那西普制剂的SEC级分

在以上描述的依那西普制剂的SEC分析中，鉴定并研究了三个SEC色谱图部分。按照从所述SEC柱子洗脱的顺序被分析的部分为：(1)代表似乎通过完整依那西普分子之间的非共价静电吸引装配的完整依那西普TNFR:Fc融合蛋白的聚集体(下文的“聚集体”或聚集体含量)的高分子量部分；(2)代表完整的依那西普TNFR:Fc融合蛋白(下文指“单体”或“单体含量”)的单体部分；(3)似乎代表依那西普分子一个片段或众多片段的部分，，其中TNFR：分子融合蛋白已经从单体裂解；所述融合蛋白在该分子的铰链区处丢失Fab部分的臂。最常见的片段或被断开的形式，如通过SEC测量，被称为片段3。在进行SEC分析中，将观察到聚集体先洗脱，随后是单体，随后是片段3。

以下表格显示由如上描述的SEC分析测定的聚集体、单体和片段3的相对量。

表I

单体的SEC分析

注意：表I、II和III所报道的量为重量百分比

T₀＝制剂保持5℃并在生成24小时内分析。

T₁＝制剂在40℃储存一周。

T₂＝制剂在40℃储存两周。

表II

聚集体的SEC分析

注意：表I、II和III所报道的量为重量百分比

T₀＝制剂保持5℃并在生成24小时内分析。

T₁＝制剂在40℃储存一周。

T₂＝制剂在40℃储存两周

表3

片段3的分析

注意：表I、II和III所报道的量为重量百分比

T₀＝制剂保持5℃并在生成24小时内分析。

T₁＝制剂在40℃储存一周。

T₂＝制剂在40℃储存两周。

表IV

单体含量的SEC分析

(T₄＝4周/25℃)

下表IV显示根据本发明制备的依那西普制剂当在25℃储存四周(用符号T₄表示)时的单体(依那西普)含量。在以下表格中T₀代表在5℃的样品温度下制剂制备24小时内进行的SEC测量值；且T₄代表在25℃储存4周后经受SEC分析的依那西普制剂样品。

表V

聚集体含量的SEC分析

(T₄4周/25℃)

下表V显示根据本发明制备的依那西普制剂在25℃储存四周后的聚集体含量。在以下表格中T₀代表在5℃的样品温度下制剂制备24小时内进行的SEC测量值；且T₄代表在25℃储存4周后进行SEC分析的依那西普制剂样品。

依那西普制剂的HIC分析

下表(表VI和VII)显示对样品3:5和3:8进行的疏水作用色谱(“HIC色谱”)的结果。HIC色谱以本领域内已知的方式执行并大体如美国专利7,294,481中所描述，其通过引用的方式并入本文。样品在t₀(在5℃制备24小时内)进行评价并在25℃储存两周(t₂)后(参见表VI)或在25℃储存四周(t₄)后(参见表VII)再次评价。HIC色谱图的峰1被认为是或包括上文SEC数据讨论中所称的“片段3”，其使用SEC鉴定和定量；峰2为上文SEC数据讨论中所称的依那西普单体；峰3包括上文SEC数据讨论中所称的“聚集体”。应当进一步理解的是，在此所用的术语“峰1”、“峰2”和“峰3”也构成对通过引用的方式被并入本文的美国专利7,294,481的图4中公开和提及HIC峰1、峰2和峰3的引用。

表IV

在40℃储存两周后的HIC数据

表VII

在25℃储存四周后的HIC数据(T₄)

-------------------------------------------------------------------------------------------------

下表VIII至表XVI含有在制剂3:5(参见以上实施例3)和以实施例4(依那西普的制备)描述的方式产生的含有依那西普的材料上进行的稳定性测试结果。基于在不同温度包括5℃下一个、两个和三个月的存储，使用SEC、HIC和用于显微镜可见微粒的FlowCam分析评价此制剂3:5的稳定性。以下为用于进行这些稳定性试验的方法学：

大量依那西普储存。未制剂的散装依那西普在2-8℃储存，如所述包装插页所示。

UV光谱。使用UV光谱测定不同稳定性样品中的蛋白浓度。使用0.1mm路径长度单元，散装物质(50 mg/mL Enbrel)在280nm的吸光度被测定为0.625，导致1.30 mL/mg*cm的消光系数。此值用于本案中所有计算。

依那西普制剂的透析和浓缩。所有缓冲剂都制备成含有所有缓冲组分的两个1L体积中。在去离子水中透析盒冲洗五分钟后，散装材料装载入Slide-A-Lyzer透析装置(10kD截断，1至3mL体积)。透析样品在2-8℃，1L缓冲剂中进行五小时透析，随后在2-8℃，在第二个1L缓冲剂中过夜第二次透析。当透析所述依那西普制剂3:5时，使用两个4L透析件，因为所述制剂需要24mL原料蛋白。

使用Amicon Ultra10K截断过滤式离心机(2mL尺寸)将所有样品浓缩至其目标值以上。使用UV测定样品的新浓度，其随后被使用制剂缓冲剂稀释至合适的水平。

热稳定性样品孵化。透析和浓缩后，热稳定性样品被无菌过滤至生物安全柜。使用无菌移液管和高压蒸汽处理的移液管尖，样品被转移至预先标签的和高压蒸汽处理的1mL冻干小瓶。小瓶使用灭菌的丁基塞塞住并用铝帽夹住。然后所有小瓶被转移至热稳定性烤箱。

排阻色谱(SEC)。使用不同的方法进行排阻色谱(SEC)。在本文称为“方法2”的SEC方法中，制备流动相缓冲剂以含有50mM磷酸钠单碱一水合物和150mM精氨酸HCl。使用1M NaHO调节pH至6.5。使用Phenomonex Yarra3micron SEC3000,30cm×4.6mm进行分离。为进行分离，柱子被带至室温(23℃)，使用流动相在0.5mL/min的流速下平衡。使用自动进样针将一微升的50mg/mL依那西普制剂注射至所述柱子。该分离在0.5mL/分钟的流速下10分钟完成。在此期间在280nm波长下检测柱洗脱液。

在下文称为“方法3”的另一SEC方法中，NaCl以100mM浓度，pH6.3作为盐用于流动相，替代精氨酸HCl。

在本文称为方法1的另一SEC方法中，所述SEC分析如下进行：所述流动相缓冲剂被制备以含有50mM磷酸钠单碱一水合物和150mM精氨酸。使用1MHCl调节pH至6.5。所有分离使用成线性连接至Tosoh TSK-Gel G4000SW×l7.8mm×30cm(cat.no.8542)的Tosoh TSK-Gel SW×l6mm×4cm保护柱(cat.no.8543)进行。为进行分离，使所述柱子至室温(23℃)并使用流动相在0.5mL/min的流速下平衡。使用自动进样针将5微升的50mg/mL依那西普制剂进样至所述柱子。该分离在0.5mL/分钟的流速下30分钟完成。在此期间280nm波长下检测柱洗脱液。

排阻色谱色谱图的整合。所有整合使用Chromeleon software(Dionex)进行。整合之前，将不含依那西普的缓冲剂的SEC色谱图从所有色谱图中减去。所以整合在2分钟和8分钟(CHS)或12分钟和26分钟(Innovator)的保留时间之间进行。使用七个参数定义峰。检测峰的最小面积被设置为0.05mAu*min。峰检测的二维敏感度被设置为0.01mAu和75秒。使用手动整合工具手动地添加峰肩。所有被检测峰以两个步骤手动调节。第一，调节峰基线(该峰的底边界)至水平线。第二，调节所述峰基线的垂直位置至色谱图基线的垂直位置。所述色谱图基线值被定义为不存在分析物的信号。在此情况下，不存在分析物的信号被定义为在2分钟保留时间mAu中的吸光度。

疏水作用色谱(HIC)。在注射入色谱柱前未稀释的制剂样品被装载入HPLC小瓶中。根据下表列出的参数通过HIC分离样品。

表4.HIC方法说明

用于测试制剂3:5的方法说明。方法开发工作首先使用无样品程序的Manuel Prime在7/10/12进行(液液界面)。在流动池中可见显著的混合效果，因此选择替代的气隙程序(有样品的Manual  Prime)用于样品评估。

冻结的所述基线(T0)制剂3:5样品被接收，且在-20℃储存直至在周围环境解冻。一旦解冻，该制剂被储存于冷藏温度(2-8℃)。所述T0样品方法包括相配的缓冲剂预处理步骤以适应流动池。在装载所述样品前，将0.4mL或更多的配合的制剂缓冲液穿过该系统冲洗。测定出此预处理不是必需的，因此不用于t3测试时间点。

将已在5℃和25℃经受三个月热应力的制剂3:5的样品在所述FlowCAM分析中进行评价。于其被分析的日期解冻所有样品。一旦解冻，其被储存于冷藏温度(2-8℃)。

仪器和设备

FlowCAM仪器：               Model VS1,Serial#551具有Sony SX90相机和具有1mL注射器的C70泵(流体成像技术)

FlowCAM软件：               DSP Firmware Version：54；version3.0.3

流动池:                     Field of View(FOV FC80)，具有80μm的深度和700μm的宽度(流体成像技术)

物镜：                      10×

背景设置(方法和设置参数)

方法：                      具有样品的Manual Prime(气隙)

样品分析：                  0.200mL体积，有0.170mL被分析

流速：                      0.100ml/min

自动成像速度：              22帧每秒

效率：                      38.7％

运行时间：                  1.7分钟

Distance to Nearest

Neighbor:               0微米

Close Hole:                 5iterations

图像：                      5拼贴图像边界填补

颗粒分割：                  暗阈值15.00，亮阈值15.00

接受域：                    左15，右1255，顶端0，底端959

相机：                      快门8

获得                        57

自动成像速度：              22frames per second

闪光相机延迟:               100毫秒

闪光持续时间：              18.5毫秒

直径(ESD)：                 最小2.00，最大1000.00微米

在运行样品之前，安装所述流动池和物镜并进行视野和聚焦优化。系统认证包括运行空白水和多个复制品中的颗粒尺寸标准。在运行样品之前进行清洁程序以保证颗粒计数在通常在样品间1000颗粒/mL以下，或复制品间低于5％样品颗粒/mL的可接受的水平。该常规清洁过程在清洁剂之间和作为最终冲洗在测定计数水平前使用水(Millipore Direct-Q type1,0.22m过滤,18.2M)。在开始所述样品分析之前，一旦该颗粒技术达到可接受的每mL颗粒水平，就将所述样品仔细地用移液管吸入所述样品尖端并装载入所述流。

每次运行期间和之后立即测定运行质量，使用VisualSpreadSheet中的一系列的诊断工具包括使用各种颗粒特性(例如尺寸、圆度、长度、长宽比)的x-y捕获图(以显现流型动力学)，对直径尺寸的长宽比图(鉴定阻塞颗粒)，运行期间的图像检测和在运行结束的图像分析。

使用被称为当量球径(ESD)的流体成像技术软件测量技术来测定单个颗粒尺寸。ESD为基于36个样品测量值(每5°进行)的颗粒的平均费里特测量值。费里特测量值为接触该颗粒相对侧的两个平行切线之间的垂直距离。

以下数据表格描述制剂3:5经受三个月热应力的表现：

(注意：表VIII至表XIII中，括号中的数字(例如3:6)指被测试的制剂。标志“C”为对照样品，其中根据实施例4制备的50mg/ml的依那西普存在于由25mM磷酸钠、1％蔗糖、100mM氯化钠和25mM精氨酸盐酸盐组成的制剂中。

表VIII

一个、两个和三个月稳定性

SEC数据

单体含量

(制剂3:5和对比物)

¹Sec方法1；²SEC方法2；³SEC方法3

(注意：表VIII至表XIII中，括号中的数字(例如3:5)指制剂。标志“C”为对照样品，其中根据实施例4制备的50mg/ml的依那西普存在于由25mM磷酸盐缓冲剂、1％蔗糖、100mM氯化钠和25mM精氨酸盐酸盐组成的制剂中。)

表IX

一个、两个和三个月稳定性

SEC数据—“片段3”

(制剂3:5和对比物)

²SEC方法2；³SEC方法3.

表X

两个月稳定性

SEC数据—“聚集体”

(制剂3:5和对比物)

²SEC方法2。

表XI

HIC峰1(断开的/片段化的形式)

一个、两个和三个月

储存

(制剂3:5和对比物)

表XII

HIC峰2(依那西普)

一个、两个和三个月

储存

(制剂3:5和对比物)

表XIII

HIC峰3(错折叠/聚集的材料)

一个、两个和三个月

储存

(制剂3:5和对比物)

使用FlowCam流动成像系统评价制剂3:5的显微镜下可见颗粒。这些仪器被设计以测量显微镜下可见颗粒(SVP)的水平。其被初始(表XIV)然后在5℃(表XV)和25℃(表XVI)三个月后测量。与上面示出的象征三个月热应力后制剂3:5中聚集或错折叠材料的低水平的SEC和HIC数据的相符，制剂3:5表现出显微镜下可见颗粒的低水平(每mL具有少于10000个尺寸大于5μm的颗粒)。

在存在于表XIV至XVI的数据中，所述对比物与示于以上表VIII至XIII的相同，即含有50mg/ml如实施例4制备的依那西普的制剂，被提供于包含25mM磷酸盐缓冲剂、1％蔗糖、100mM氯化钠和25mM精氨酸盐酸盐的制剂内。

表XIV

由FlowCam测量的制剂3:5的不同尺寸的颗粒初始数/mL(热应力之前)

制剂3:5对比物

2-5μm14000±160007400±80005-10μm3100±34001900±180010-15μm500±500290±26015-25μm180±120100±8025-40μm130±13050±4040-50μm20±2010±10>50μm10±1010±20>2μm17000±210009700±11000>5μm3900±41002300±2200

表XV

由FlowCam测量的制剂3:5在5℃储存三个月不同尺寸的颗粒数/mL

制剂3:5对比物2-5μm38000±180007900±42005-10μm8000±33001600±70010-15μm820±270150±3015-25μm200±3040±3025-40μm110±4010±1040-50μm0±00±0>50μm10±100±0>2μm47000±220009600±4900>5μm9100±36001800±700

表XVI

由FlowCam测量的制剂3:5在25℃储存三个月不同尺寸的颗粒数/mL

制剂3:5对比物2-5μm16000±700015000±100005-10μm4300±15003200±200010-15μm490±150310±19015-25μm190±60170±14025-40μm60±4050±4040-50μm10±1010±10>50μm20±1010±10>2μm22000±860019000±13000>5μm5000±17003800±2300

上表VIII至XVI中存在的数据显示根据本发明的氨基酸稳定的制剂能够达到堪比或优于包含精氨酸作为稳定剂的对比剂型的储存稳定性。

本发明的其它实施方案从说明书考虑和本文公开的本发明的实践对本领域技术人员将是明显的。说明书和实施例应被认为仅为例示而本发明真正范围和精神为权利要求所指出。