来自天然存在的海洋微藻群和露天盐磐中培养的海洋微藻的可用于发动机的脂肪酸甲酯(生物柴油)以及副产物的价值附加

摘要

本发明教导了获得的说明书和使用天然存在的海洋微藻群以及以成本有效的方式培养在晒制盐磐中的海洋微藻制备可用于发动机的海洋微藻脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法。副产物流的效用增加了本发明的吸引力。

说明书

发明领域

本发明涉及使用收集自印度西海岸的天然存在的含有脂质的微藻群 用于生产脂肪酸甲酯(FAME)并且证明了后者用于普通运输工具(vehicle) 行驶的适用性。本发明还涉及在晒制盐磐中培养可容易收获的含有脂质的 微藻生物质(培养自小球藻(Chlorella variabilis)登录号PTA-12198)及其向 同样可用于发动机的FAME的进一步转化。

发明背景

可以参考Daemon Fairless的文章，Biofuel：The little shrub that could- may be(生物柴油：小灌木能够-可以是).Nature(2007)449，652-655，和 Laurent Lardon等的文章，Life-Cycle Assessment of Biodiesel Production  from Microalgae(从微藻生产生物柴油的生活周期评估)，Environmental  Science & Technology(2009)43：17，6475-6481，其中突出了食物相对于燃 料的复杂问题并且强调了对这样的不影响食品生产的生物质源的需求。

同样就以下内容可以参考D.H.Lee，Algal biodiesel economy and  competition among bio-fuels(海藻生物柴油经济和生物燃料之间的竞争)， Bioresource Technology(2011)102，43-49：耕地缺乏以及对生产可用于燃料 生产的生物质的备选地点的需求，其中微藻培养不需要大面积的耕地。此 外，培养地点可以在沙漠地区或在浅海沿海水域中。

可以参考Ghosh等美国专利7666234，其中，公开了利用边际地来生 产可用于发动机的生物柴油。所述生物质是陆地来源的。

可以参考题为“Biodiesel production by simultaneous extraction and  conversion of total lipids from microalgae，cyanobacteria，and wild  mixed-cultures(通过同时萃取和转化来自微藻、蓝细菌和野生混合培养物的 总脂质来生产生物柴油)”的文章(B.D.Wahlen等Bioresource Technol.， 2011，102，2724-2730)。

可以参考Doan等的文章，Screening of marine microalgae  for biodiesel feedstock(筛选用于生物柴油给料的海洋微藻)，Biomass and  Bioenergy(2011)35：7；2534-2544，和Matsunaga等的文章，Characterization  of marine microalga，Scenedesmus sp.strain JPCC GA0024 toward biofuel  production(海洋微藻栅藻属物种菌株JPCC GA0024向生物燃料生产的表 征).Biotechnology Letters(2009)31：1367-1372，其中据报道，海洋微藻物 种含有可以充当生物柴油来源的脂质。

可以参考美国专利7977076；Nasrin Moazami等，Biomass and lipid  productivities of marine microalgae isolated from the Persian Gulf and the  Qeshm Island(分离自波斯湾和Qeshm岛的海洋微藻的生物质和脂质生产 率)。

也可以参考Brennan等的文章，Biofuels from microalgae：A review of  technologies for production，processing，and extractions of biofuels and  co-products(来自微藻的生物燃料：用于生产、加工和萃取生物燃料和副产 物的技术的综述).Renewable and Sustainable Energy Reviews(2010)14： 557-577，该文章陈述了，通常培养微藻以获得小体积高价值的产品，这需 要有限的土地面积或者可以在室内在光-生物反应器中培育生物质的场所。

可以参考Hankamer等的文章，Photosynthetic biomass and H₂  production by green algae：from bioengineering to bioreactor scale-up(通过绿 藻生产光合生物质和H₂：从生物工程改造到生物反应器放大)Physiologia  Plantarum(2007)131：10-21，和Wang等的文章，CO₂ bio-mitigation using  microalgae(使用微藻的CO₂生物缓解).Applied Microbiology and  Biotechnology(2008)79：5；707-718；其中强调了微藻生物质的光合生产对 生物柴油生产的重要性。

可以参考Douskova等的文章，Simultaneous flue gas bioremediation and  reduction of microalgal biomass production costs(同时获得废气生物整治和 微藻生物质生产成本的降低)，Applied Microbiology & Biotechnology(2009)， 82：179-185，其中宣称，可以通过使用废气作为CO₂的丰富来源来提高微 藻的生物质生产率。

可以参考任意数目的文章，如Griffiths等，Lipid productivity as a key  characteristic for choosing algal species for biodiesel production(脂质生产率 作为选择用于生物柴油生产的海藻物种的重要特征).Journal of Applied  Phycology 2009，21：493-507，以及Tom Bruton等为Sustainable Energy  Ireland准备的报告，A Review of the Potential of Marine Algae as a Source of  Biofuel in Ireland(海藻作为爱尔兰的生物燃料来源的潜力的综述) (2009)，该报告提及了海洋微藻作为生物柴油来源的重要性，但是没有公 开在与大规模生物柴油生产相关的规模上这样的培养在哪里进行或其将 如何进行。

可以参考Pittman等的综述，The potential of sustainable algal biofuel  production using wastewater resources(使用废水资源的可持续藻类生物燃 料生产的潜力)，Bioresource Technology(2011)102，17-25。然而，其中没有 提及其在生物柴油生产中的效用，此外，来自农业废物的混合培养物中的 微孢藻属物种(Microspora sp.)未被确定或未用于脂质。

可以参考Syed Zahir Shah & Habib-ur-Rehman Khattak的工作(Some  Green Algae from Paddy Fields of Mathra(District Peshawar)(来自Mathra的 稻田(Peshawar地区)的一些绿藻)，Syed Zahir Shah & Habib-ur-Rehman  Khattak，Department of Botany，Islamia College，Peshawar)，作为关于生 物多样性的研究的一部分，其公开了在信德河(Sind River)附近存在微孢藻 属物种(Microspora sp.)。其中没有提及生物质的任何效用。

可以参考题为Cell division and wall structure in Microspora(微孢藻中 的细胞分裂和细胞壁结构)的文章(Picketts-Heaps.New Phytologist，(1973) 72，347-355)，其中讨论了微孢藻属物种(Microspora sp.)的细胞学。其中记 述了，这样的藻类可以以藻群的形式存在。其还记述了所述藻类可能含有 或可能不含有脂质。没有提及利用这样的藻群用于生物柴油制备的任何尝 试。

可以参考Mata等的文章，Microalgae for biodiesel production and other  applications：A review(微藻用于生物柴油生产和其他应用：综述). Renewable and Sustainable Energy Reviews(2010)14：217-232；该文章列举 了含有脂质(并且，在这个意义上，具有作为生物柴油的来源的潜在重要性) 的多个海洋微藻物种。

还可以参考Greenwell等的文章，placing microalgae on the biofuels  priority list：a review of the technological challenges(将微藻放入生物燃料优 先名单：技术挑战的综述).Journal of the royal society interface(2010)，7： 703-726，该文章公开了，不同的微藻以不同速率生长并且虽然一些具有高 的油含量，但是它们由于其他原因如缓慢的生长速率、难以收获生物质等 而不能实际利用。

可以参考US2009／0298159A1，其中提供了一种由藻类制备生物柴油 的方法，所述方法利用用于生物柴油生产的小球藻(Chlorella variabilis)的 两阶段(自养和异养)生长期，所述方法包括以下一系列步骤：培养光合自 养藻类，浓缩细胞然后将它们转移到发酵罐中用于异养培养。在异养培养 阶段期间加入有机碳。显然，该方法在密闭系统中进行并且需要浓缩细胞， 这极大的消耗能源。此外，没有提及生物柴油的特性也没有提及在车辆上 进行的任何试验。

可以参考网址为 www.treehugger.com／chevron-backs-solazyme-to-develop-algal-biodiesel-tech  nology.html，题为“Chevron Backs Solazyme to Develop Algal Biodiesel  Technology”，日期为2008年2月2日的文章，其中Solazyme由糖源通过 在暗处发酵生产生物柴油。

从现有技术显然的是，还没有公开具有成本效益的用于由这样的获得 自天然存在的微藻群的培养的或收获的生物质生产脂肪酸甲酯的方法。本 发明尝试克服所有这些基本限制并尝试发展新的、简化的并且具有成本效 益的用于由微藻群生产脂肪酸甲酯以及由废物副产物流(waste co-stream) 生产具有附加价值的副产物的方法。随着每次后续收集，发现所述地点处 的水的总碳减少。这可以归因于从相同地点的频繁收集。

可以参考Ghosh等的专利申请PCT／IN2010／000192，该申请公开了小 球藻属(Chlorella)海洋微藻物种的培养和兼氧生长的优势。其中没有提及 由生物质制备生物柴油也没有提及其大规模的实际培养以使所述生物质 被视为大体积、可负担得起的给料。

可以参考Greenwell等的文章，placing microalgae on the biofuels  priority list：a review of the technological challenges(将微藻放入生物燃料优 先名单：技术挑战的综述).Journal of the royal society interface(2010)，7： 703-726，以及Chisti，Y等的文章；Biotechnology Advances(2003)，所述 文章显示了微藻生物质下游加工的困难以及作为结果的高的能量损失。其 中最重要的是难以从高度稀释的悬浮液收获生物质。

可以参考文章 http：／／www.treehugger.com／renewable-energy／chevron-backs-solazyme-to-dev  elop-algal-biodiesel-technology.html和 http：／／www.treehugger.com／cars／solazyme-b100-algae-biodiesel-goes-on-the-ro  ad.html，所述文章公开了车辆依靠B100微藻生物柴油行驶。然而，所述 文章指出，在异养条件下使用糖类作为有机碳源培养生物质。

没有关于获得自天然存在的海洋微藻群或在实际自养生长条件下在 晒制盐磐中产生的耐热海洋微藻生物质的任何生物柴油的性能的报道。

在沿西海岸寻找潜在微藻的过程中，我们的团队通过在Google earth 软件中观察到的图像发现少数地点，这些地点显示获得一些所需微藻的可 能性。我们发现的地点之一位于经度70□54.959′E和纬度20□42.391N(地 点1)，另一个地点位于经度68□59.876’和纬度22□23.975′(地点2)，印度， 其显示密集的微藻群。对所述藻群的显微镜检查(形态学)揭示了所述藻群 含有多种藻类物种，其中发现微孢藻属物种(Microspora sp.)是占优势的。 现有的由藻类生产生物柴油的方法是非常耗能的。因此，已经进行尝试去 开发具有成本效益的方法用以由海洋微藻制备生物柴油。

可以参考Bligh，E.G.，Dyer，W.J.，A rapid method for total lipid extraction  and purification(用于总脂质萃取和纯化的快速方法)，Canadian Journal of  Biochemistry and Physiology(1959).37，911-917。Lee等Comparison of  several methods for effective lipid extraction from microalgae(从微藻有效萃 取脂质的若干方法的比较)，Bioresource Technology101(2010)S75-S7，所 述从海洋微藻生物质萃取脂质的方法典型地需要利用极性溶剂进行萃取 并且除了甘油三酯以外还产生大量的磷脂，磷脂是生物柴油生产所不需要 的。

发明目的

本发明的主要目的是利用天然存在的海洋微藻聚生体的藻群和晒制 盐磐中培养的自沉积的海洋微藻作为可用于发动机的脂肪酸甲酯(生物柴 油)的来源。

另一个目的是鉴定刚毛藻属物种(Cladophora sp.)(ATCC登录号 PTA-12199)和微孢藻属物种(Microspora sp.)(ATCC存活测试在进行中)作 为上述海洋微藻聚生体的藻群中的优势物种。

另一个目的是在晒制盐磐中人工培养这样的漂浮藻群和／或通过施加 胁迫条件提高脂质含量。

另一个目的是使用分离自印度西海岸的小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登录号PTA-12198)作为对于在夏季条件下在印度的古吉拉特在晒 制盐磐中培养是理想的自沉积的和耐热的海洋微藻株。

另一个目的是使与从生物质分离脂质相关的能量损失最小化。

另一个目的是使用可容易收获的生物质作为降低能量损失的手段。

另一个目的是创造可能以利用现有的用于晒制盐生产的约10万英亩 过剩土地大规模培养海洋微藻生物质。

另一个目的是通过使用海水、廉价的无机营养物并且避免用于搅拌培 养基的机械配件来最小化培养的投入成本，同时在夏季的几个月期间仍然 实现最大的日生长速率45g(干基)／m²／天。

另一个目的是利用晒制盐生产中遵循的基本准则如重力进料和液体 的磐间转移。

另一个目的是晒干收获的生物质。

另一个目的是使用挥发性非极性溶剂如己烷从晒干的生物质萃取脂 质以使非所需的脂质在总的萃取的脂质质量中的比例最小化。

另一个目的是任选地利用化石柴油用于其中使用混合生物柴油的萃 取过程。

另一个目的是利用太阳热能用于萃取和脂质分离过程以使能量输出： 输入比最大化。

另一个目的是从用过的生物质获得最大价值。

另一个目的是通过简单的和具有成本效益的方式精制原料油。

其后，另一个目的是利用已知的FAME生产方法，如在美国专利 7666234中公开的。

另一个目的是证明具有基本参数如粘度、游离脂肪酸含量、氧化稳定 性、游离和总甘油、磷含量、水分含量等的所需规范的海洋微藻FAME的 生产。

另一个目的是证明利用制备自海洋微藻群的B20生物柴油和制备自 小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA-12198)的B100生物柴油的 标准运输工具的行驶。

另一个目的是利用副产物粗甘油流用于培养的微藻的加速生长和更 高的脂质含量，如在现有技术中公开的那样。

发明概述

本发明提供用作生物柴油的脂肪酸甲酯(FAME)，所述酯制备自天然 漂浮的海洋微藻群或在晒制盐磐中培养期间形成的沉降的海洋微藻的厚 层或其混合物。

在本发明的一个实施方案中公开了脂肪酸甲酯(FAME)1，其中用于生 产生物柴油的藻群包含作为优势株的含有脂质的微孢藻属物种 (Microspora sp.)(等待ATCC登录号)或刚毛藻属物种(Cladophora sp.) (ATCC登录号PTA12199)和晒制盐磐中培养的海洋微藻的厚层，所述厚层 包含耐热的小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中所述脂质通过利用 己烷的萃取从包含微孢藻属物种(Microspora sp.)(等待ATCC登录号)的海 洋微藻群萃取，如通过GC-MS分析，所述脂质具有的组成为：0.6％的14：0 脂肪酸，9.4％的16：0脂肪酸，0.7％的16：1脂肪酸，3.7％的18：0脂肪酸， 33.2％的18：1脂肪酸，50.4％的18：2脂肪酸，0.7％的20：0脂肪酸，1.3％的 22：0脂肪酸。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中脂质通过利用己烷 的萃取从来自小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)的海洋 微藻萃取，如通过GC-MS分析，所述脂质具有的组成为：0.4％的14：0脂 肪酸，12.1％的16：0脂肪酸，1.0％的16：1，1.0％的16：2脂肪酸，4.2％的 18：0脂肪酸，29.4％的18：1，45.7％的18：2脂肪酸，4.8％的18：3脂肪酸， 1.4％的22：0。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中所述脂质通过利用 己烷的萃取从包含刚毛藻属物种(Cladophora sp.)(ATCC登录号PTA12199) 的海洋微藻群萃取，如通过GC-MS分析，所述脂质具有的组成为：0.9％ 的14：0脂肪酸，0.4％的15：0脂肪酸，21.5％的16：0脂肪酸，1％的16：1脂 肪酸，2.9％的18：0脂肪酸，21.2％的18：1脂肪酸，22.3％的18：2脂肪酸， 0.5％的20：0脂肪酸，16.3％的20：1脂肪酸，0.4％的22：0脂肪酸，11.4％的 22：1脂肪酸，0.7％的24：0脂肪酸，0.6％的24：1脂肪酸。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中对获得自微孢藻属 物种(Microspora sp.)的脂质级分进行精制和酯基转移从而获得这样的 FAME，如通过GC-MS分析，所述FAME具有包含以下各项的组成：9.92％ 的16：0脂肪酸，2.44％的18：0脂肪酸，28.27％的18：1脂肪酸，59.37％的 18：2脂肪酸，和5-30ppm的BHT抗氧化剂。

在本发明的另一个实施方案中公开了来自微孢藻属物种(Microspora  sp.)的FAME，其是清澈的黄色液体，具有0.872gm／ml密度，4.5cSt(在 40℃)粘度，0.1014％总甘油和0.0086％游离甘油。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其作为B20混合物用于 满载状态下的普通未改造的柴油运输工具(vehicle)并且符合排放要求。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中对获得自小球藻 (Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)的脂质级分进行精制和酯基 转移从而获得这样的FAME，如通过GC-MS分析，所述FAME具有包含 以下各项的组成：6.9％的16：0脂肪酸，3.1％的18：0脂肪酸；32.6％的18：1 脂肪酸，和57.3％的18：2脂肪酸，以及5-30ppm的BHT抗氧化剂。

在本发明的另一个实施方案中公开了来自小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登录号PTA12198)的FAME，其是清澈的芥黄色液体，在25℃和 40℃的密度分别为0.8704和0.8591g／cm³；在40℃的粘度为4.8cST；总 甘油，0.15％；游离甘油，0.02％；CFPP，水分含量，0029％；-5℃；磷， 5.1ppm；氧化稳定性，0.43年(25℃)和0.12年(40℃)，并且通过标准量热 试验测量的热值为9842kcal／kg。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其作为B100生物柴油 用于满载状态下的权利要求8的相同的未改造的柴油运输工具并且符合排 放要求。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中在七月-十二月期间 从70°54.959′E，20°42.391N收获在微孢藻属物种(Microspora sp.)中占优 势的海洋微藻群。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中在自养条件下，在 一月-六月期间，在位于72°07.316’E21°47.4888′N；海拔，28英尺的盐磐 中培养小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中晒制盐磐中的小球 藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)的生长速率为11.67-45.56 g/m²/天。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中微孢藻属物种 (Microspora sp.)的藻群的利用己烷萃取的脂质产率为5.22-16.32％。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中培养的小球藻 (Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)的利用己烷萃取的脂质产率 为11.11-11.21％。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中通过每1000L海水 培养基加入3-6kg的碳酸氢钠，1-2kg硝酸钠和0.01-0.02kg硫酸亚铁来 影响小球藻(Chlorella variabilis)的生长速率和脂质产率。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中任选地加入所述 FAME方法的粗甘油副产物流以使生物质生产率提高50-200％。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中发现在开放培养中， 在除夏季以外的时期期间，太阳反射器提高小球藻(Chlorella variabilis)的 生长速率和脂质生产率。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中将溶剂萃取脂质后 的残留生物质用于生产生物肥料、水产饲料、类胡萝卜素源和能量源。

在本发明的另一个实施方案中公开了FAME，其中粗甘油的副产物流 被用于通过兼氧生长的海藻生产率和／或用于生物可降解的生物聚合物。

本发明的另一个方面提供由天然收获的具有微孢藻和刚毛藻ATCC登 录号PTA-12199的聚生体的飘浮藻群和培养的微藻群以及大量培植的选 择的微藻的耐热株(小球藻(Chlorella variabilis)ATCC登录号PTA-12198) 制备可用于发动机的脂肪酸甲酯(生物柴油)以及利用来自微藻物质的副产 物以及来自脂肪酸甲酯的副产物的综合方法，并且所述方法包括以下步 骤：

a)从不同地点收集微藻群聚生体并且洗涤以除去粘附的砂子和泥土 颗粒ii)鉴定所述藻群中存在的微藻物种并且在实验室条件下使用海水和 CSMCRI Experimental Salt Farm(实验盐场)(ESF)海盐培养所述藻 群并在箱中模仿自然条件来以进一步增殖。

b)从所述藻群分离含油的微藻物种(微孢藻、根枝藻属(Rhizoclonium)、 螺旋藻属(Spirulina)、小球藻、刚毛藻、硅藻纲(Diatoms)、颤藻属(Oscillatoria  spp.)等)。

c)在户外在实验盐场中在18m²和90m²的箱中大量培养含油的微藻 物种，生物质的自沉积有助于容易的收获，并且回收作为营养物的上清液 用于下一批次的接种。

d)干燥所述微藻群，之后将干燥的微藻群研磨成细粉。

e)从生物质有效萃取油，包括使用球磨机／蒸汽预处理生物质，之后 进行非极性溶剂萃取／Soxhlet等，并且回收所述溶剂。

f)精制原料油。

g)遵循已知的酯基转移方法以制备可用于发动机的生物柴油，如在现 有技术中那样。

h)使用生物柴油副产物流提高通过兼氧生长的海藻生产率，如在现有 技术中公开的(专利申请PCT／IN2011／000655)和／或用于生产其他有用的材 料如生物可降解的生物聚合物(WIPO专利申请WO／2011／027353)。

i)利用用过的生物质和在生物柴油的合成期间产生的废水用于生物 气生产。

j)利用用过的生物质作为水产饲料(aqua-feed)和作为生物肥料。

k)利用残留生物质和去油的饼用于制备煤饼。

l)从去油的残留生物质提取类胡萝卜素。

m)配制适于使满载的且没有任何发动机改造的车辆(Chevrolet Tavera) 行驶的混合物B20和B100。

在本发明的一个实施方案中公开了制备用作生物柴油的可用于发动 机的脂肪酸甲酯的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)收集具有微孢藻属物种(Microspora sp.)和刚毛藻属物种 (Cladophora sp.)的聚生体的天然存在的微藻群和培养的小球藻(Chlorella  variabilis)以获得海藻生物质；

(ii)晒干生物质至残留水分水平为5-10％；

(iii)通过蒸汽鼓风或渗透性冲击预处理步骤(ii)的生物质以破坏细胞 壁；

(iv)使用己烷作为溶剂或任选地利用其中燃料要以混合物形式使用 的柴油机从步骤(iii)的海藻生物质萃取脂质从而获得原料油；

(v)除去己烷并且用硅藻土处理所得的原料油或任选地直接用硅藻土 处理步骤(ii)的萃取物以去除磷脂、色素和其他杂质；

(vi)过滤以除去悬浮的固体并且如果需要，进一步处理步骤(v)的油萃 取物以降低游离脂肪酸(FFA)含量以获得精制油；

(vii)对步骤(vi)的精制油进行碱催化的酯基转移，分离FAME，并且 对其进行进一步纯化以获得可用于发动机的FAME。

在本发明的另一个实施方案中公开了生产FAME的方法，其中获得自 微孢藻属物种(Microspora sp.)的FAME具有如通过GC-MS分析的包含以 下各项的组成：9.92％的16：0脂肪酸，2.44％的18：0脂肪酸，28.27％的18：1 脂肪酸，59.37％的18：2脂肪酸，和5-30ppm的BHT抗氧化剂。

在本发明的另一个实施方案中公开了一种方法，其中获得自小球藻 (Chlorella variabilis)的FAME具有如通过GC-MS分析的包含以下各项的 组成：6.9％的16：0脂肪酸，3.1％的18：0脂肪酸；32.6％的18：1脂肪酸， 和57.3％的18：2脂肪酸，以及5-30ppm的BHT抗氧化剂。

在本发明的一个实施方案中，本发明提供从天然的和培养的微藻群以 及大量培养的选择的微藻株制备可用于发动机的脂肪酸甲酯(生物柴油)以 及利用来自微藻物质的副产物和来自脂肪酸甲酯的副产物的综合方法。

在本发明的另一个实施方案中，微藻群是不同微藻物种的聚生体，其 中微孢藻和刚毛藻属物种ATCC登录号PTA-12199是优势物种。

在本发明的另一个实施方案中，将具有必需微量营养物／CSMCRI-ESF 盐的海水用于微藻的户外大量培养。

在本发明的其他实施方案中，使用选自由以下各项组成的组的溶剂进 行油萃取：己烷，氯仿，甲醇，丙酮，四氢呋喃，二乙醚；优选地，己烷， 氯仿和甲醇。

在本发明的另一个实施方案中，将生物柴油副产物流用于生产PHA- 生物聚合物，生物气，气化，肥料，水产饲料，类胡萝卜素，并用于生产 煤饼。

发明简述

通过在Google Earth软件中观察到的图像选择显示获得一些所需微藻 的可能性的一些地点。所述地点之一位于经度70°54.959′E和纬度20° 42.391N(地点1)，另一个地点位于经度68°59.876’和纬度22°23.975′(地 点2)，印度。其显示密集的漂浮微藻群。对所述藻群进行的显微镜检查(形 态学)揭示，所述藻群含有多种微藻物种，其中发现微孢藻属物种 (Microspora sp.)和刚毛藻属物种(Cladophora sp.)ATCC登录号PTA-12199 是占优势的。现有的由藻类生产生物柴油的方法消耗大量能量。因此，已 经进行尝试去开发具有成本效益的方法用以由海洋微藻群中的聚生体以 及分离的和大量培养的小球藻(Chlorella variabilis)株ATCC登录号 PTA-12198制备生物柴油。

利用一种综合方法将含有微孢藻属和刚毛藻属物种ATCC登录号 PTA-12199(分别在地点1和2占优势)的微藻群用于生物柴油生产是独特 的。天然藻群广泛分布并且发现其在被收获后的数周内再生。除此之外， 观察到其也在其他实验地点再生。发现具有占优势的微孢藻属和刚毛藻属 物种ATCC登录号PTA-12199的聚生体的藻群在环境参数的可变范围内存 活并生长。

本发明的新特征：

主要的创造性在于以下：

·认识到，微藻的收获需要大量能量并且在形成含有脂质的漂浮海洋 微藻群如具有微孢藻属物种(Microspora sp.)(等待ATCC登录号)和刚毛藻 属物种(Cladophora sp.)(PTA12199)作为优势物种的那些中利用自然的巧 妙，所述藻类可以简单地从水中除去并被进一步加工。

·认识到，虽然自然界中的某些条件有助于海洋微藻群的自然生长， 但是该种自然生长限于某些特定时期如季风后的几个月，并且在其他月份 如夏季的月份期间，其很少出现。在大量工作后进一步认识到，并不总是 容易的模拟那些自然条件，并且海洋微藻的其他变种可以更好地适于培 养。

·认识到，如果需要培养海洋微藻以补充天然储存油料和用于全年的 收获，则有用的方法是在季风后的时期以可持续的方式从自然界中收获， 并且之后借助于在晒制盐磐中对海洋微藻进行培养，这可以为大规模培养 提供理想的机会，假定在印度多至50％的现有的用于产盐的土地搁置不用 并且这些可以用于生产用途。

·鉴定来自印度水域的小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA 12198)为耐热的变种，其在夏季月份期间在自养条件下生长良好，观察到 在最小营养输入的情况下的最大干生物质生产率为45g／m²／天，并且还避 免了高耗能的手段如跑道池中采用的连续搅拌。

·还观察到，在夏季月份期间，在主要为热天的条件下，所选择的小 球藻属株生长并且沉积，由此在底部形成厚层，在排去充当后续培养批次 的接种物的上清液后，所述厚层可以被容易地收获。

·认识到，可行的是通过使用安置在盐磐中的太阳反射器使小球藻甚 至在非夏季月份里也生长，所述太阳反射器增强在盐磐上入射的辐射并且 因此提高温度和入射光子辐射，两者对生物质生产率和脂质产率都具有积 极作用。

·认识到，脂质具有极性和非极性两种类型，并且后者是可用于发动 机的生物柴油所需要的，并且之后为了所需的脂质级分牺牲高的脂质产 率，并且利用非极性溶剂如己烷和柴油代替通常使用的极性溶剂如甲醇／ 氯仿来萃取生物质。

·还认识到，虽然将非极性溶剂用于萃取产生更清洁的油级分，但是 微藻细胞壁的去除效率较低；因此，提供蒸汽鼓风作为萃取之前的预处理； 进一步认识到这样的方法，如果它们是太阳能驱动的，则将是能效更高的。

·使用简单方法如在硅藻土上过滤来精制原料油，并且由此使用碱催 化的酯基转移的常规方法如现有技术中公开的用于生产可用于发动机的 脂肪酸甲酯的那些。

·由天然收获的和培养的海洋微藻生产甲酯，其品质适用于普通柴油 运输工具。

·使用来自海洋微藻生物柴油生产的副产物甘油流作为营养物来提高 在兼养条件下的生物质生产率和脂质含量，如在现有技术中公开的。

·将脂质萃取后的残留生物质用于各种各样的应用如肥料、类胡萝卜 素源、水产饲料、能量源等。

·将生活污水和NaCl含量低而营养物如钙、镁和硫酸盐含量高的粗海 盐用作用于微藻群和分离的海洋微藻培养物的生长的培养基补充剂。

实施例1

借助于Google Maps^TM，对沿海水域中的绿斑进行查找，这可以帮助 我们识别可能的漂浮微藻群。发现一些明显的绿斑位于果阿的沿海区域 (Madkai；15°41.0616’N，73°95.6227’E)，喀拉拉邦(Vellanathuruthu Road； 9°01.6659’N，76°52.5022’E)，孟加拉邦(Porr Canning，22°31.5577’N， 88°67.3307’E；，Dongajora，22°13.2696’N，88°60.2676’E；Haldia refinery， 22°04.9408’N，88°07.308’E)，第乌(Nagoa路旁，70□54.959′E，20□42.391 N)和古吉拉特(Okha，68□59.876’，22□23.975′)。对在第乌和古吉拉特识 别的地点进行地面实测，并且确实发现绿色的微藻的漂浮藻群。

实施例2

收集实施例1的藻群并且在显微镜(Carl Zeiss Axio Imager，40x)下观 察以进行分类学鉴定。两种藻群都显示其中绿藻(Chlorophycae)家族占优势 的微藻的聚生体。收集自70□54.959′E、20□42.391N的藻群具有微孢藻 作为优势形式，而收集自68□59.876’、22□23.975′的藻群以刚毛藻为优势。 聚生体的相关物种的分离通过使用连续稀释法进行。用蒸馏水洗涤海藻藻 群以去除粘附的污垢和杂质，并且对其进行进一步离心。收集上清，并且 接种在具有不同培养基(BG-11，BBM，Zarrouk’s，ASN-III等)的24孔组 织培养平板中。使用1：10稀释度进行连续稀释。在25℃，将组织培养平 板保持在人造光(300lux)中，12小时光照和黑暗周期。在可见的生长后， 将富集的培养物划线在固体1％琼脂糖平板上。将培养皿在人造光(300lux) 下温育，12小时光照和黑暗周期，25℃。将分离的培养物无菌接种到液体 培养基中并且保持在人造光(300lux)中，12小时光照和黑暗周期，25℃。 将来自以上两个地点的藻群冻干并且送至美国模式菌种保藏中心 (American Type Culture Collection Centre)(ATCC)以在分配登录号前进行 存活测试。具有刚毛藻作为优势含脂质株的一个藻群已被给予ATCC登录 号PTA-12199，而另一个具有微孢藻作为优势含脂质株的藻群的存活测试 在进行中。

实施例3

将天然存在的海洋微藻群从在地点经度70°54.959′E和纬度20° 42.391N占优势的微藻中挑出。在3-4周后有规律地视察该地点以研究藻 群的再生长。在夏季期间，生物质生产率为22.22g／m²／天并且总脂质含量 为10％；在季风期间，生物质生产率为6.03g／m²／天并且总脂质含量为 9.61％，而在冬季，获得16g／m²／天的生物质生产率和12.85％的总脂质含 量。该实施例教导我们，可行的是以可持续的方式从自然界收获微藻群。

实施例4

在冬季期间(气温25-30℃)，在开放式箱中研究提高的太阳辐射对 ATCC-小球藻(Chlorella variabilis)的生物质生产率的作用。用小球藻培养 物(OD_540nm=1.65)的10％接种物接种具有1.51m²面积和0.3m深度、盛有 200L海水培养基的两个箱子，在具有反射器的情况下14天后的干生物质 产率为5.03g／l，而在对照箱中产率为4.07g/l。该实施例教导我们，太阳 反射器可以具有对培养过程的有益效果，尤其是在环境温度低于最佳时。

实施例5

小球藻(Chlorella variabilis)ATCC登录号PTA-12198的大量培养在研 究所的实验盐磐(21°47.488′N72°07.316′E海拔：28英尺)进行。培养在三 月-六月期间进行。培养期间的室外温度为45±3℃。为此目的所需的培养 物首先生长在各自具有18m²的面积并首先被用作接种箱的两个箱子中。 通过测量pH、540nm处的OD和生物质产率来对所述箱子进行定期监测。 在达到5g／l(湿基)的细胞浓度后，将培养物用于接种各自具有18m²的面 积的7个箱子以及各自具有90m²面积的3个箱子。定期监测pH、540nm 处的OD、生物质产率和环境参数。使用在其末端系有细绳的空心管手动 对箱子进行搅动(每天三次)达18天。在培养20天后，观察到，自动沉积 的生物质在箱子底部形成厚层。关于生物质生产率的数据在下表中给出。

池塘 体积(L) 干生物质(kg) 生物质生产率(g／m²／d) P2 5000 11.75 32.64 P3 5000 9.8 27.22 P4 5000 8.4 23.33 P5 5000 10.08 28 P10 5000 7.5 20.83 P11 5000 13.95 38.75 P12 5000 4.2 11.67 XL1 20000 52.1 28.94 XL2 20000 73.8 41 XL3 20000 56.2 31.22

将来自每个箱子的上清转移到空箱中，并且收集沉积的生物质并晒 干。该实施例教导我们在晒制盐磐中培养小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登录号PTA-12198)的可行性。

实施例6

在另外的两块磐中重复实施例5的实验。向5000L的海水培养基加 入25kg碳酸氢钠、6kg硝酸钠和62.5g硫酸亚铁。发现生物质生产率增 加，如从下表中可见的。

池塘 体积(L) 干生物质(kg) 生物质生产率(g／m²／d) P6 5000 16.2 45 P8 5000 16.4 45.56

该实施例教导我们，通过向海水培养基中添加某些重要的营养物可以 提高生物质生产率。

实施例7

对收获自自然界的微藻群进行脂质的己烷萃取。将己烷用作溶剂。数 据提供在下表中。可以看出，脂质含量在5-16％变化。

实施例8

利用实施例5和6的小球藻(Chlorella variabilis)生物质重复实施例7 的研究。数据提供在下表中。该实施例教导我们，培养的生物质提供更加 一致的油产率。

批次 收获的月份 干重(Kg) 水分(％) 原料油重(Kg) 产率(％) ESF／NPL／第1批 六月-11 209.9 8.0 21.45 11.11 ESF／NPL／第2批 六月-11 53.0 7.8 5.45 11.15 ESF／NPL／第3批 六月-11 48.0 7.1 5 11.21

实施例9

下表给出关于如通过以上GC-MS分析的实施例7和8的原料油的脂 肪酸组成的相关数据。

实施例10

将在实施例8的第1批中获得的18.738kg的油放入不锈钢容器中并 且加热至90℃。向其加入1.8kg的硅藻土。对油进行过滤从而获得15.916 kg的澄清油。分析澄清油的FFA含量并且发现其含有0.6％FFA。取13gm 的NaOH并将其溶解在65ml的水中。将因此制备的碱液添加到澄清油中 并搅拌15分钟。对其进行过滤以除去脂肪酸盐。滤液清油重15.210kg。 使用2.92kg(3.756L)的甲醇和399.24gm的KOH来对精制油进行酯基转 移。在环境温度将内容物搅拌90分钟并使其静置60分钟。分离含有过量 醇和KOH的甘油层；甘油层的重量为4kg。将生物柴油层用682gm的甘 油洗涤并允许其沉降60分钟。甘油洗涤液重687gm。然后将生物柴油层 用1L水洗涤直至pH达到7。通过在110℃加热内容物对其进行干燥。分 析因此获得的13.35kg生物柴油的游离甘油、总甘油、水分、粘度和密度。 数据提供在下表中。

实施例11

同样利用获得自实施例7的第2批中的油进行实施例10的研究。数 据提供在以下表6中。

编号 分析 结果 1. 生物柴油的总甘油 0.1014％ 2. 生物柴油的游离甘油 0.0086％ 3. 密度 0.872gm／ml 4. 粘度40℃ 4.5CS(在40℃) 5 热值 9879kcal／kg

实施例12

下表分别提供如通过GC-MS分析的实施例10和11的脂肪酸甲酯的 脂肪酸组成。明显的是，组成非常纯净。

实施例13

实施例12的数据证明实施例10和11的海洋微藻生物柴油可以用于 发动机。制备自实施例11的脂肪酸甲酯的B20生物柴油和实施例10的 B100生物柴油可以直接用于没有任何改造的普通TAVERA汽车。在试车 中没有见到任何类型的困难，并且估计了与化石柴油的里程相似的里程。 关于依靠实施例11的B100生物柴油的试车，一位记者有话要说：“该记 者在部长的陪伴下试驾了Tavera。经历等同于任何其他柴油车，伴有柴油 发动机发出的单调的轰鸣。绕Central Secretariat区域的两公里的驾乘是平 缓的并且没有任何暂时停顿”(Dinsa Sachan，“Biodiesel from microalgae  becomes a reality(来自微藻的生物柴油变成现实)”，Down to Earth，March  30，2012；www.downtoearth.orgg.in)。

实施例14

121℃的蒸汽，15-psi的压力，通过热值4590kCal／Kg的30g的小球 藻生物质的床。将10.1g此蒸汽处理的样品放入纤维素套管中以用于在溶 剂容量为150ml的Automated Soxhlet中、利用100ml己烷、在80℃进行 4小时脂质萃取。研究表明，在蒸汽预处理后己烷萃取变得更有效，并且 与通常所需的16小时相比，完全萃取仅需10小时。

实施例15

在1L容量的密闭反应罐中由50g实施例8的去油的微藻生物质进行 类胡萝卜素的提取。利用500ml的80％(v／v)丙酮进行提取，并且保持在 暗室中，200rpm持续磁力搅拌。在连续磁力搅拌3小时后，将溶液蒸发， 并且将不含丙酮的提取物经由滤纸过滤从而获得类胡萝卜素作为渗余物。 获得的类胡萝卜素有2-4％。

实施例16

由藻群和小球藻的去油的残留生物质生产生物气

将来自实施例7和8的残留生物质用于生物气生产。在生物气生成后， 具有大量微量营养物、碳和氮的生物质浆料可以用作生物肥料。残留生物 质也可以用作水产饲料；它具有蛋白质、碳水化合物和必需微量营养物。 可以制备残留生物质的煤饼。在油萃取后从废的微藻生物质生产生物气是 潜在可行的并且可以相当大地提高从生物质的能量产率。因此，为了使由 微藻生产生物柴油可持续，其已被认为是必要步骤(Torres和Jeison，2010)。

取用具有1884.52kcal／kg(实施例7的去油饼)和1679.00Kcal／kg(实施 例8的去油饼)热值的残留的去油生物质。将来自生物气工厂的消化的浆料 用作用于生产生物气的接种物。将设备分成三个部分(1)蒸煮器(5.0L)、(2) 玻璃托瓶(1.0L)和(3)液体移置瓶(1.0L)。蒸煮器在4.0L容量处有标记，并 且通过施用硅带和真空润滑脂，使其接缝气密。利用1.0L的显色试剂将 1.0L容量的玻璃托瓶填充至其标记处。将刻度尺粘在其上以准确地测量 气体生产。对于每个测试样品(残留生物质)以连续和间歇模式进行生物气 实验，并且对于连续和间歇方法各自有一个控制蒸煮器。该实验的水力停 留时间(HRT)为30天，并且进料底物为5％；对于连续蒸煮器，每天通过 进料管用134ml测试样品[其为5％(6.7g)生物质+67ml浆料+67ml t／w] 替换134ml(4.0L／30天=0.1333或134ml)样品，而在间歇蒸煮器中直接加 入200g生物质(5％，4.0L)。将比率为1：10(多种维生素片剂和半胱氨酸 盐酸盐)的稀释的活化溶液用于引发用于生物气生产的微菌群的生长，并且 保持厌氧条件。每天分析所得的流出的浆料的参数如总固体、总挥发性固 体、pH、电导率、总有机碳、可用的氮和可用的磷。每天也测量总生物气 生产。对于间歇方法，实施例7和8的去油生物质的蒸煮器中的平均每日 生物气产量分别为426.26和446.02ml d^-1，而对于连续方法，分别为270.51 和473.15ml d^-1。

实施例17

将含有粗甘油的微藻生物柴油副产物用作小球藻(Chlorella variabilis) 兼养和异养生长的营养源，其中所有烧瓶都含有100ml海水培养基以及变 化的藻类生物柴油废渣(ABWR)以用于在室温进行兼氧生长。在接种后， 540nm处的OD为0.5。在8天后，在5g／L的ABWR(兼养)的情况下，观 察到生物质生产率最大。该实施例教导我们将粗甘油流用于提高生物质生 产率的效用。

实施例18

将用过的微藻生物质用作生物肥料来促进生长并且可以代替化学肥 料。刚毛藻的NPK含量为1.2：0.03：0.6(％)，微孢藻的NPK含量为1.4：0.01： 1.1(％)，小球藻的NPK含量为2.19：0.01：1.0(％)。在两块玉米作物的耕地 中进行实验，其中6道用于对照(K₂O)，4道各用于刚毛藻、微孢藻和小球 藻，在当量营养物(K₂O)基础上。在生长八周后，测量植物高度、每株植 物的叶子的数目、每株植物的穗轴的数目、穗轴的长度和宽度以及叶绿素 指数。结果显示，小球藻给出最佳结果，其中平均植物高度为167.8±7.34 cm，每株植物14.8±0.583片叶子，每株植物2个穗轴，32.0±0.84cm穗轴 长度、7.24±0.24cm穗轴宽和49.31±0.03叶绿素指数(Opti-Sciences  CCM-200，USA)，与之相比地，对照(化肥K₂O)158.4±2.79cm植物高度， 每株植物13.6±0.4片叶子，每株植物1.6±0.25个穗轴，28.6±0.75cm穗轴 长度，7.24±0.24cm穗轴宽和40.25±1.97叶绿素指数。当将小球藻用作生 物肥料以代替K₂O(对照)时，观察到产率增加16.43％。该实施例教导我们 去油饼的进一步效用。

实施例19

实施例8的去油饼的热值为1765.91kcal／kg。将藻类与10重量％的湿 牛粪混合，转化为直径4cm、深2cm的手工煤饼，并且将其在露天晒干。 然后将30kg这样的干燥的生物质加料到安装在研究所的ESF房屋处的 15Kg／hr的生物质气体发生器中。在气体发生器运行约10分钟后，使用在 线气体分析仪记录发生炉煤气的可燃组分。该气体以黄色火焰燃烧。该实 施例教导我们，去油饼也可以用于生物质气体发生器。

时间 一氧化碳 甲烷 氢 4.15P.M 0.30 0.23 2.52 4.20P.M 0.33 0.25 2.67 4.25P.M 0.33 0.30 3.13 4.30P.M 0.35 0.32 3.79

本发明的优势如下：

●本发明提供了通过收获天然存在的这样的藻类的藻群以可持续的 方式生产海洋微藻生物质的低成本选项。

●本发明还具有这样的优势，即发现可以在露天的晒制盐磐中培养耐 热的小球藻属，即使是在热的夏天条件下，仍具有高的生物质生产率和良 好的脂质含量。

●本发明还具有这样的优势，即生物质的培养需要最小营养物和能量 输入。

●本发明还具有这样的优势，即生物质是容易收获的。

●本发明还具有这样的优势，即，借助于非极性溶剂，适于生产生物 柴油的仅有用的脂质部分被选择性地萃取。

●本发明还具有这样的优势，即，使用简单方法精制可利用非极性溶 剂萃取获得的原料油，并且之后可以通过已知方法将所述油容易地加工成 高品质生物柴油。

●本发明还具有这样的优势，即，证明这样的获得自海洋微藻源的甲 酯可以被利用用于(甚至是在纯的条件下(B100))运行没有任何发动机改造 的普通柴油运输工具。

●本发明还具有另外的优势，即证明某些副产物流的直接效用和／或价 值附加。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种生产用作生物柴油的可用于发动机的脂肪酸甲酯(FAME)的方 法，所述方法包括以下步骤：

(i)收集选自由微孢藻属物种(Microspora sp.)和刚毛藻属物种 (Cladophora sp.)或培养的小球藻(Chlorella variabilis)组成的组的天然存在 的海洋微藻群以获得海藻生物质；

(ii)晒干所述生物质至残留水分水平为5-10％；

(iii)通过蒸汽鼓风或渗透性冲击预处理步骤(ii)的生物质以破坏细胞 壁；

(iv)使用己烷作为溶剂或任选地利用其中燃料待以混合物形式使用 的柴油机从步骤(iii)的海藻生物质萃取脂质以获得原料油；

(v)去除己烷并且用硅藻土处理所得的原料油或任选地直接用硅藻土 处理步骤(ii)的萃取物从而除去磷脂、色素和其他杂质；

(vi)过滤以除去悬浮的固体并且如果需要，进一步处理步骤(v)的油萃 取物以降低游离脂肪酸(FFA)含量以获得精制油；

(vii)对步骤(vi)的精制油进行碱催化的酯基转移，分离FAME，并且 对其进行进一步纯化以获得可用于发动机的FAME。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质通过利用己烷萃取从包 含微孢藻属物种(Microspora sp.)(等待ATCC登录号)的海洋微藻群萃取， 如通过GC-MS分析所述脂质的组成为：0.6％的14：0脂肪酸，9.4％的16：0 脂肪酸，0.7％的16：1脂肪酸，3.7％的18：0脂肪酸，33.2％的18：1脂肪酸， 50.4％的18：2脂肪酸，0.7％的20：0脂肪酸，1.3％的22：0脂肪酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中脂质通过利用己烷萃取从海洋微 藻小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)萃取，如通过 GC-MS分析所述脂质的组成为：0.4％的14：0脂肪酸，12.1％的16：0脂肪 酸，1.0％的16：1，1.0％的16：2脂肪酸，4.2％的18：0脂肪酸，29.4％的18：1， 45.7％的18：2脂肪酸，4.8％的18：3脂肪酸，1.4％的22：0。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质通过利用己烷萃取从包 含刚毛藻属物种(Cladophora sp.)(ATCC登录号PTA12199)的海洋微藻群 萃取，如通过GC-MS分析所述脂质的组成为：0.9％的14：0脂肪酸，0.4％ 的15：0脂肪酸，21.5％的16：0脂肪酸，1％的16：1脂肪酸，2.9％的18：0脂 肪酸，21.2％的18：1脂肪酸，22.3％的18：2脂肪酸，0.5％的20：0脂肪酸， 16.3％的20：1脂肪酸，0.4％的22：0脂肪酸，11.4％的22：1脂肪酸，0.7％的 24：0脂肪酸，0.6％的24：1脂肪酸。

5.根据权利要求2所述的方法，其中对获得自微孢藻属物种 (Microspora sp.)的脂质级分进行精制和酯基转移从而获得如通过GC-MS 分析具有包含以下的组成的FAME：9.92％的16：0脂肪酸，2.44％的18：0 脂肪酸，28.27％的18：1脂肪酸，59.37％的18：2脂肪酸，和5-30ppm的 BHT抗氧化剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述FAME为清澈的黄色液体， 具有0.872gm／ml密度，4.5cSt(在40℃)粘度，0.1014％总甘油和0.0086％ 游离甘油，并且如通过标准量热试验测量的热值为9879kcal／kg。

7.根据权利要求5-6所述的方法，其中所述FAME作为B20混合物 用于满载状态下的普通未改造的柴油运输工具并且符合排放要求。

8.根据权利要求3所述的方法，其中对获得自小球藻(Chlorella  variabilis)(ATCC登录号PTA12198)的脂质级分进行精制和酯基转移从而 获得如通过GC-MS分析具有包含以下的组成的FAME：6.9％的16：0脂肪 酸，3.1％的18：0脂肪酸；32.6％的18：1脂肪酸，和57.3％的18：2脂肪酸， 以及5-30ppm的BHT抗氧化剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述FAME是清澈的芥黄色液 体，在25℃和40℃分别具有0.8704和0.8591g／cm³的密度；在40℃具 有4.8cST的粘度；总甘油，0.15％；游离甘油，0.02％；CFPP，水分含量， 0.029％；-5℃；磷，5.1ppm；氧化稳定性，0.43年(25℃)和0.12年 (40℃)，并且如通过标准量热试验测量的热值为9843kcal／kg。

10.根据权利要求8-9所述的方法，其中所述FAME作为B100生物 柴油用于满载状态下的普通未改造的柴油运输工具并且符合排放要求。

11.根据权利要求1和5-7所述的方法，其中在七月-十二月期间从70° 54.959′E，20°42.391N收获在微孢藻属物种(Microspora sp.)中占优势的 海洋微藻群。

12.根据权利要求1、3和8-10所述的方法，其中在位于72°07.316′E 21°47.4888′N的盐磐中；海拔，28英尺，在自养条件下，在一月-六月期 间培养所述小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)。

13.根据权利要求1、3、8-10和12所述的方法，其中所述晒制盐磐 中的小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)的生长速率为 11.67-45.56g／m²／天。

14.根据权利要求1-2、5-7和11所述的方法，其中对微孢藻属物种 (Microspora sp.)藻群利用己烷萃取的脂质产率为5.22-16.32％。

15.根据权利要求1、3、8-10和12-13所述的方法，其中对培养的小 球藻(Chlorella variabilis)(ATCC登录号PTA12198)利用己烷萃取的脂质产 率为11.11-11.21％。

16.根据权利要求1、3、8-10、12-13和15所述的方法，其中通过每 1000L的海水培养基加入3-6kg的碳酸氢钠，1-2kg硝酸钠和0.01-0.02kg 硫酸亚铁影响小球藻(Chlorella variabilis)的生长速率和脂质产率。

17.根据权利要求1、3、8-10、12-13和15-16所述的方法，其中任选 加入来自所述FAME过程的副产物流的粗甘油以使生物质生产率增加 50-200％。

18.根据权利要求1、3、8-10、12-13和15-17所述的方法，其中太阳 反射器提高在除夏季以外的时期期间开放培养中小球藻(Chlorella  variabilis)的生长速率和脂质生产率。

19.根据权利要求1-18所述的方法，其中脂质的溶剂萃取后的残留生 物质被用于生产生物肥料、水产饲料、类胡萝卜素源、和能量源。

20.根据权利要求1-18所述的方法，其中粗甘油的副产物流被用于通 过兼氧生长的海藻生产率和／或用于生产生物可降解的生物聚合物。