一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒

摘要

本发明提供了一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQIDNO.1～12。本发明为LHON临床诊断提供快速、准确、廉价的基因水平检测手段，可实现LHON的预防和早期及时诊断，能够发现高危人群，提高LHON的诊断率，进行有效的产前遗传咨询和婚前咨讯，提高人口素质，降低家庭和国家的医疗开支。

说明书

技术领域

本发明涉及诊断试剂盒，用于Leber遗传性视神经病变的体外诊断。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一种 以母系遗传为特征的线粒体遗传病，是迄今临床上最常见的遗传性视神经疾病之 一。LHON临床主要表现为双眼急性或亚急性中心视力下降，也是目前青少年致 盲的主要原因之一，严重威胁青少年健康。

尽管目前许多临床检查手段如眼底荧光血管造影(FFA)、视网膜电图(ERG) 等，有助于LHON的辅助诊断；但对于遗传性的LHON病变早期，大部分患者 无家族史或家族史不清，临床表现轻微如仅有视神经损害，使得其早期临床诊断 及治疗十分困难，这可能导致病情持续发展从而致盲，因此LHON的早期诊断尤 为必要。

目前研究已经明确线粒体DNA(mtDNA)基因突变是LHON致病的主要分 子机制，使得基因水平诊断成为LHON临床确诊的最直接手段。尽管目前已有 部分基因分析方法在试图对LHON mtDNA突变进行了筛查分析，但由于费用昂 贵、手续复杂、耗时长、漏诊率高等因素，限制了其在临床推广使用。

因此有必要开展一些新的基因诊断技术，并将其用于搭建LHON基因诊断 检测平台，为LHON临床早期临床诊治提供重要依据；更重要的是对发现高危 人群，进行有效的产前遗传咨询及诊断、婚前筛查，在提高人口素质方面具有极 其重要的社会意义；而且可减少家庭和国家的医疗负担，具有重大的经济应用前 景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，能够 一次鉴定正常与突变的DNA，以及其突变是纯合子或杂合子。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，包括SEQ ID NO.1～12。SEQ  ID NO.1～4，SEQ ID NO.5～8，SEQ ID NO.9～12分别针对Leber遗传性视神经 病变(LHON)致病相关的三个原发突变位点G3460A(ND1)、G11778A(ND4)与 T14484C(ND6)，针对每一个突变位点分别采用四条引物-两条外引物和两条内引 物，两条外引物扩增的片段作为PCR体系的内对照，排除体系自身原因造成的误 诊，两条内引物分别反向扩增突变及正常的等位基因，能够一次鉴定正常与突变 的DNA，以及其突变是纯合子或杂合子。

本发明试剂盒的诊断原理如图1所示，P1和P2为扩增含有突变点基因片段的 外引物，S1和S2为两条特异性引物即内引物，分别与DNA双链的两条单链互补， 其3’端正好与SNP位点重合，由引物的3’端控制着引物的延伸反应，根据延伸 产物的长度确定SNP类型，并通过在引物的3’端区域引入一个人为不匹配碱基 来提高延伸反应的特异性。野生型(W)基因只能与相匹配的特异性引物S2发生 延伸反应。特异性引物S1由于其3’末端碱基与模板不配对，故不发生延伸反应， 因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和P1S2；同理，突变型(M)基因仅与其 配对的特异性引物S1发生延伸反应，特异性引物S2由于其3’末端碱基与模板不 配对，故不发生延伸反应.因此PCR扩增后的产物只有DNA片段P1P2和S1P2。

上述Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒，SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2： SEQ ID NO.3：SEQ ID NO.4＝10：10：1：1，SEQ ID NO.5：SEQ ID NO.6：SEQ ID NO.7： SEQ ID NO.8＝20：20：1：1，SEQ ID NO.9：SEQ ID NO.10：SEQ ID NO.11：SEQ ID  NO.12＝5：5：1：1，以摩尔比计。本试剂盒特定调整外引物与内引物用量，其效果 在于有效的平衡外侧与内侧PCR产物扩增效率，提高结果的特异性，便于扩增结 果的准确判读。

为了更简单方便的得到更清晰易辨的检测结果，上述Leber遗传性视神经病 变体外诊断试剂盒的使用方法是将引物SEQ ID NO.1～4、SEQ ID NO.5～8或SEQ  ID NO.9～12分别与DNA扩增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95℃保温10min， 然后按95℃30s、65℃或55℃30s、72℃30s的条件进行35个循环，在72℃保温 10min进行成像或测序检测。

有益效果

1.使用本发明的试剂盒，可直接通过PCR扩增条带的长度，一次性鉴定Leber 遗传性视神经病变正常与突变的DNA以及其突变是纯合子或杂合子。

2.本发明排除了多引物使用时对检测结果的交叉影响，特异性强，无假阳性、 无杂带产生，准确率高，阳性检出率可达到95％以上。

3.本发明可进行三个单管PCR同时扩增，一次电泳得到检测结果，所需仪器简 单，具有操作简单、观察简单、耗费低廉、检测快速而准确的优势，适合临床推 广普及，产业化应用。

4.本发明为LHON临床诊断提供快速、准确、廉价的基因水平检测手段，可实现 LHON的预防和早期及时诊断，能够发现高危人群，提高LHON的诊断率，进行有 效的产前遗传咨询和婚前咨讯，提高人口素质，降低家庭和国家的医疗开支。

附图说明

图1本发明试剂盒的诊断Leber遗传性视神经病变的原理；

图2实施例1①PCR扩增产物成像结果；

图3实施例1②PCR扩增产物成像结果；

图4实施例1③PCR扩增产物成像结果；

图5为实施例1①m.11778G>A位点无突变的测序图局部；

图6为实施例1①m.11778G>A位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为G 突变为A；

图7为实施例1①m.11778G>A位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为G 突变为A；

图8为实施例1②14484T>C位点无突变的测序图局部

图9为实施例1②m.14484T>C位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为T 突变为C

图10为实施例1②m.14484T>C位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为T 突变为C

图11为为实施例1③m.3460G>A位点无突变的测序图局部

图12为实施例1③m.3460G>A位点为纯合突变的测序图局部，方框内显示为G 突变为A；

图13为为实施例1③m.3460G>A位点为杂合突变的测序图局部，方框内显示为G 突变为A；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发 明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

1.样本：人全血提取的DNA(50～100ng/ul)。样本1和2为正常对照，是指扩 增模板来源于来源于无下述三个突变的正常人血DNA；样本3和4为纯合突变 体，是指扩增模板来源于三个位点的阳性参考品质粒DNA，阳性参考品质粒为 m.11778G>A；m.14484T>C；m.3460G>A三位点的人工突变片段质粒；样本5 和6为杂合突变，是指扩增模板来源于阳性参考品质粒与无突变的正常人血DNA 混合模版。

2.试剂：Hot Start Green Master Mix，2×：包含2×Green Go Taq  Reaction Buffer(pH8.5)、400μM dATP、400μM GATP、400μM dCTP、400μM dTTP、 4mM MgCl₂、Nuclease-Free Water、DNA聚合酶。

3.T-ARMS-PCR反应体系及扩增程序

①采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，成像结果如图2所示。

外引物：P1：GCCTACCCCTTCCTTGTACTATCCCTATG

P2：TTAATAGTGGGGGGTAAGGCGAGGTT

内引物：S1：CAAACTACGAACGCACTCACAGGCA

S2：TTGAAGTCCTTGAGAGAGGATTATGAGGC

反应体系

PCR扩增程序

②采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，成像结果如图3所示。

外引物：P1：ACCCCTCTCCTTCATAAATTATTCAGCTT

P2：GTGGTCGGGTGTGTTATTATTCTGAATT

内引物：S1：CATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACAAT

S2：AATAGTTTTTTTAATTTATTTAGGGGGAAGGG

反应体系

PCR扩增程序

③采用以下引物、体系及程序对各样本进行PCR扩增，成像结果如图4所示。

外引物：P1：AGTATTATACCCACACCCACCCAAGAACA

P2：GATTGAGTAAACGGCTAGGCTAGAGGTG

内引物：S1：GCTACTACAACCCTTCGCTGCCA

S2：GGGCTCTTTGGTGAAGAGTTTTATTGC

反应体系

PCR扩增程序

4.用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物

制备2.5％琼脂糖凝胶(含Go1dview)后，各取7ul PCR产物点样。稳压120V， 35min，条件下电泳，完毕后在凝胶成像仪中观察结果并照相。

5.实验结果

①m.11778G>A位点引物T-ARMS-PCR结果

P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出350bp、276bp两条带，m.11778G>A 位点纯合突变的标本扩增出350bp、127bp两条带，杂合突变的标本扩增出350bp、 276bp、127bp三条带，如图2所示。(M为500bp DNALadder；1和2为正常对 照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)

②m.14484T>C位点引物T-ARMS-PCR结果

P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出286bp、111bp两条带，m.14484T>C 位点纯合突变的标本扩增出286bp、236bp两条带，杂合突变的标本扩增出286bp、 236bp、111bp三条带，如图3所示(M为500bp DNA Ladder；1和2为正常对 照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)

③m.3460G>A位点引物T-ARMS-PCR结果

P1、P2、S1、S2特异性的将正常对照标本扩增出460bp、292bp两条带，m.3460G>A 位点纯合突变的标本扩增出460bp、217bp两条带，杂合突变的标本扩增出460bp、 276bp、217bp三条带，如图4所示(M为1000bp DNALadder；1和2为正常对 照；3和4为纯合突变；5和6为杂合突变)。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医学大学附属儿童医院，黄轶

<120>一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒

<160>  <210> 1  <211> 29 <212> <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 1

gcctacccct tccttgtact atccctatg                                          29

 

 

<210> 2  <211> 26  <212>

<213> Artificial(人工序列)

 

<400> 2

ttaatagtgg ggggtaaggc gaggtt                                             26

 

<210> 3  <211> 25 <212> <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 3

caaactacga acgcactcac aggca                                              25

 

<210> 4  <211>  29  <212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 4

ttgaagtcct tgagagagga ttatgaggc                                          29

 

<210> 5  <211>  29  <212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 5

acccctctcc ttcataaatt attcagctt                                          29

 

<210>6 <211>  28  <212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 6

gtggtcgggt gtgttattat tctgaatt                                           28

 

<210>7 <211>   30  <212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 7

catcgctgta gtatatccaa agacaacaat                                         30

 

<210>8 <211> 32  <212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 8

aatagttttt ttaatttatt tagggggaag gg                                      32

 

<210>9 <211> 29  <212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 9

agtattatac ccacacccac ccaagaaca                                          29

 

<210>10 <211> 28  <212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 10

gattgagtaa acggctaggc tagaggtg                                           28

 

<210>11 <211>  23 <212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 11

gctactacaa cccttcgctg cca                                                23

 

<210>12 <211>  27

<212>  <213> Artificial(人工序列)

 

<400> 12

gggctctttg gtgaagagtt ttattgc                                            27