一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法

摘要

本发明公开了一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法。本发明公开的EBNA-D500DNA分子，该分子的序列如SEQ ID No.1所示。本发明公开的方法克服了Episomal质粒在人类细胞系中表达的效率较低这一缺陷，同时不影响其非整合性和长时间表达的特性。另外，EBNA-D500mRNA可显著提高含有Episomal质粒进行体细胞重编程的效率，可用来制作无外源基因的、安全性高的人类诱导多能干细胞，用于再生医学。

说明书

技术领域

本发明涉及一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法。

背景技术

干细胞与再生医学是近几年生物医学的重要研究领域，具有重大的临床 应用价值。多能干细胞可分化为各种组织器官的功能性细胞，可用来研究人 类发育、制作疾病模型，并可通过细胞移植，取代损伤病变的细胞，促进机 体创伤修复、治疗疾病。干细胞与再生医学将改变传统对于坏死性和损伤性 等疾病的治疗手段，对疾病的机理研究和临床运用带来革命性变化。如何保 证并提高干细胞的安全性是再生医学中的关键问题。常规的外源基因表达方 法有几个缺陷。干细胞分化经常需要几周的时间，以DNA质粒为主的瞬时表 达系统仅能维持几天，无法完成分化上的时间要求。以逆转录病毒和慢病毒 为工具的表达系统虽然维持时间长，但病毒会整合入人类基因组中，造成基 因突变，甚至可能导致癌症的发生^[1]。因此，建立一套高效、非整合性的长时 间基因表达系统既可以作为干细胞科研的有利工具，也可以弥补DNA质粒、 逆转录病毒和慢病毒系统功能上和安全性方面的缺陷，用于再生医学和基因 治疗。

Episomal系统是现有的一种哺乳细胞基因表达系统，含有oriP/EBNA1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1)序列^[2]。oriP/EBNA1取自Epstein-Barr 病毒，其特性为，可以结合人类细胞的DNA复制蛋白，使所连接的DNA能够 在宿主细胞染色体外稳定复制，但不会整合到宿主细胞基因组中造成突变， 因此为非整合基因表达系统^[3]。此外，Episomal系统可以在人类细胞中自我 复制，因此表达时间长，可达几周至数月，但由于其非整合的特性，最终会 被宿主细胞丢失^[4]。同时这些载体无需病毒包装就能转染，避免了病毒制作的 复杂过程。

由于Episomal质粒具有非整合性和长时间表达的特性，因此安全性高， 在干细胞和再生医学领域具有很好的应用前景。Episomal质粒也有一定的缺 点，如在人类细胞系中表达的效率较低。

1.Daniel,R.and J.A.Smith,Integration site selection by  retroviral vectors:molecular mechanism and clinical consequences.Hum  Gene Ther,2008.19(6):p.557-68.

2.Wang,J.and B.Sugden,Origins of bidirectional replication of  Epstein-Barr virus:models for understanding mammalian origins of DNA  synthesis.J Cell Biochem,2005.94(2):p.247-56.

3.Yu,J.,et al.,Human induced pluripotent stem cells free of  vector and transgene sequences.Science,2009.324(5928):p.797-801.

4.Keisuke O.,et al.,A more efficient method to generate integration-free  human iPS cells.Nature Methods,2011.8(5):p.409-412

发明内容

本发明的目的是提供一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法。

本发明提供的EBNA-D500DNA分子，该分子的序列如SEQ ID No.1所示。

EBNA-D500mRNA分子也属于本发明的保护范围，该分子的序列如SEQ ID No.2所 示。

一种提高外源基因在哺乳动物细胞中表达效率的试剂盒也属于本发明的保护范 围，包括所述的EBNA-D500DNA分子或所述的mRNA分子和Episomal质粒；

所述Episomal质粒中文名为“非整合型附着体质粒”，即含有OriP/EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen-1)序列的质粒，其中OriP为顺式结构，EBNA为反 式结构，该质粒可作为任何哺乳动物细胞表达载体。

所述试剂盒中包括使用说明书，使用说明书中记载如下内容：将外源基因插入 Episomal质粒的多克隆位点，得到重组质粒；将重组质粒与所述的EBNA-D500mRNA 分子共同转染目的哺乳动物细胞；

或，

将外源基因插入Episomal质粒的多克隆位点，得到重组质粒；将所述的EBNA-D500 DNA分子进行体外转录，得到所述的EBNA-D500mRNA分子，再将重组质粒与EBNA-D500 mRNA分子共同转染目的哺乳动物细胞；

所述哺乳动物不包括鼠。

所述重组质粒不能整合入所述哺乳动物细胞基因组；

所述Episomal质粒中文名为“非整合型附着体质粒”，即含有oriP/EBNA1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1)序列的质粒，其中OriP为顺式结构，EBNA为反 式结构，该质粒可作为任何哺乳动物细胞表达载体，具体为pCEP4质粒或pCXLE质粒；

所述pCXLE质粒在文献“Okita K,Matsumura Y,Sato Y,et al.A more efficient  method to generate integration-free human iPS cells[J].Nature methods,2011, 8(5):409-412.”中公开过。

上述试剂盒中，所述提高外源基因在哺乳动物细胞中表达效率是指增加外源基因 在哺乳动物细胞中的表达量和/或增长外源基因在哺乳动物细胞中的表达时间；

所述哺乳动物细胞为人类细胞；

所述人类细胞具体为离体的人类细胞；

所述人类细胞为如下中至少一种：人胚胎肾细胞、人类成纤维细胞、人类胚胎干 细胞、人类诱导多能干细胞、人脐带血CD34+造血干细胞；

所述人胚胎肾细胞具体为人胚胎肾细胞293FT细胞；

所述人类胚胎干细胞具体为人类胚胎干细胞H9；

所述人类诱导多能干细胞具体为人类诱导多能干细胞MIFF。

一种增强哺乳动物细胞中外源基因表达的方法也属于本发明的保护范围，包括如 下步骤：将所述的mRNA分子和带有外源基因的Episomal重组质粒共转染离体的哺乳 动物细胞，得到重组细胞，与所述带有外源基因的Episomal重组质粒单独转染的所述 离体哺乳动物细胞相比，重组细胞中外源基因的表达效率提高；

所述表达效率为所述外源基因的表达量和/或表达时间；

所述哺乳动物不包括鼠；

所述重组质粒是将所述外源基因插入所述Episomal质粒的多克隆位点得到；

所述方法为非疾病诊断或治疗方法；

所述重组质粒不能整合入所述哺乳动物细胞基因组；

所述Episomal质粒中文名为“非整合型附着体质粒”，即含有oriP/EBNA1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1)序列的质粒，其中OriP为顺式结构，EBNA为反 式结构，该质粒可作为任何哺乳动物细胞表达载体，具体为pCEP4质粒或pCXLE质粒；

所述pCXLE质粒在文献“Okita K,Matsumura Y,Sato Y,et al.A more efficient  method to generate integration-free human iPS cells[J].Nature methods,2011, 8(5):409-412.”中公开过。

上述方法中，所述的mRNA分子和所述的带有外源基因的Episomal重组质粒的质 量比为1:6—2:1，具体为5:8,1:0.8,1:1,2:1,1:6,1:2,3:2；

所述转染为化学转染或电转染。

上述任一所述的方法中，所述哺乳动物细胞为人类细胞；

所述人类细胞具体为离体的人类细胞；

所述人类细胞为如下中至少一种：人胚胎肾细胞、人类成纤维细胞、人类胚胎干 细胞、人类诱导多能干细胞、人脐带血CD34⁺造血干细胞；

所述人胚胎肾细胞具体为人胚胎肾细胞293FT细胞；

所述人类胚胎干细胞具体为人类胚胎干细胞H9；

所述人类诱导多能干细胞具体为人类诱导多能干细胞MIFF。

上述任一所述的分子在制备增强哺乳动物细胞中外源基因表达效率的产品中的应 用也属于本发明的保护范围；

和/或，

上述任一所述的试剂盒在制备增强外源基因在哺乳动物细胞中表达效率的产品中 的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述增强外源基因在哺乳动物细胞中表达效率是指提高外源基因在 哺乳动物细胞中的表达量和/或增长外源基因在哺乳动物细胞中的表达时间；

所述哺乳动物不包括鼠；

所述哺乳动物细胞具体为人类细胞；

所述人类细胞具体为离体的人类细胞；

所述人类细胞具体为如下中至少一种：人胚胎肾细胞、人类成纤维细胞、人类胚 胎干细胞、人类诱导多能干细胞、人脐带血CD34⁺造血干细胞；

所述人胚胎肾细胞具体为人胚胎肾细胞293FT细胞；

所述人类胚胎干细胞具体为人类胚胎干细胞H9；

所述人类诱导多能干细胞具体为人类诱导多能干细胞MIFF。

为改良Episomal质粒在人类细胞系中表达的效率较低这一缺陷，本发明 提供了一种能显著增强Episomal质粒表达效率的方法，同时不影响其非整合 性和长时间表达的特性。

本发明的优点和积极效果如下：

1）EBNA-D500mRNA显著增加含有OriP/EBNA1序列的质粒(Episomal质 粒)在人类细胞中的转染效率和所携带的基因的表达水平。

2）EBNA-D500mRNA可使含有OriP/EBNA1序列的质粒在人类多能干细胞 中长时间表达，表达时间达到一个月以上，表达水平高，并不受分化影响。 因此这一系统可用来指导干细胞定向分化，而且无改变干细胞基因组的危险。

3）EBNA-D500mRNA可显著提高含有OriP/EBNA1序列的质粒进行体细胞 重编程的效率，用来制作无外源基因的、安全性高的人类诱导多能干细胞， 用于再生医学。

附图说明

图1为Episomal质粒和EBNA-D500突变体系统图示。

图2为EBNA-D500mRNA显著增加Episomal质粒pCEP4-EGFP和pCXLE-EGFP 在293FT细胞中表达的效率和时间。

图3为EBNA-D500mRNA显著增加Episomal质粒pCEP4-EGFP在人类成纤 维细胞中表达的效率和时间。

图4为EBNA-D500mRNA显著增加Episomal质粒pCXLE-EGFP在人类胚胎干细胞 H9中表达的效率和时间。

图5为EBNA-D500mRNA显著增加Episomal质粒pCXLE-EGFP在人类诱导多能干 细胞中表达的效率和时间。

图6为EBNA-D500mRNA显著增加Episomal重编程质粒pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、 pCXLE-hUL和pCXLE-hSK的体细胞重编程的效率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Episomal质粒在文献“Yates J,Warren N,Reisman D,et al.A cis-acting  element from the Epstein-Barr viral genome that permits stable replication of  recombinant plasmids in latently infected cells[J].Proceedings of the  National Academy of Sciences,1984,81(12):3806-3810.”“Yates J L,Warren N, Sugden B.Stable replication of plasmids derived from Epstein–Barr virus in  various mammalian cells[J].1985.”“Vos J-M.Mammalian artificial chromosomes  as tools for gene therapy.Curr Opin Genet Develop1998;8:351–359.”“Vos  J-M.Therapeutic mammalian artificial episomal chromosomes.Curr Opin Mol Ther  1999;1:204–205.”“Yu J,Hu K,Smuga-Otto K,et al.Human induced pluripotent  stem cells free of vector and transgene sequences[J].Science,2009,324(5928): 797-801.”中公开过。

人类胚胎肾细胞系293FT购自Invitrogen公司，产品目录号为R70007。

人类成纤维细胞购自美国ATCC细胞库，ATCC CRL2429。

人类胚胎干细胞系H9购自美国WiCell干细胞库，产品目录号为WA09。

人类诱导多能干细胞MIFF的原始细胞系为人类成纤维细胞ATCC CRL2429，经mRNA 重编程而来，重编程采用STEMGENT公司的mRNA重编程试剂盒（产品号00-0071)。该 细胞由谢菲尔德大学干细胞中心细胞库馈赠。

CD1(ICR)品系小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,品系代码201。

滋养细胞为照射灭活的小鼠胚胎成纤维细胞，分离自CD1(ICR)品系小鼠13.5天 胚胎，经X射线灭活处理得到。

pRN3P在文献“Plews,J.R.,Li,J.,Jones,M.,Moore,H.D.,Mason,C., Andrews,P.W.,and Na,J.(2010).Activation of pluripotency genes in human  fibroblast cells by a novel mRNA based approach.PLoS ONE5,e14397.”中公 开过，公众可从清华大学获得。

pRN3P-EBNA-D500为将EBNA-D500序列（SEQ ID No.1）插入pRN3P质粒的EcoRI 和BamHI位点间得到。

pCAG-EGFP购自Addgene，产品目录号为11150。

pCEP4-Smad4购自Addgene，产品目录号为16483。

pCEP4-EGFP按照如下方法构建：将质粒pCAG-EGFP中的EGFP片段插入 pCEP4-Smad4的5’HindIII-3’BamHI位点间得到。

pCXLE-hOCT3/4-shp53-F购自Addgene，产品目录号为27077。

pCXLE-hUL购自Addgene，产品目录号为27080。

pCXLE-hSK购自Addgene，产品目录号为27078。

pCXLE-EGFP按照如下方法构建：将质粒pCXLE-hUL的hUL替换为pCAG-EGFP中的 EGFP片段。

以上pCEP4和pCXLE系列的质粒均为Episomal质粒。

KnockOut^TM-DMEM购自Invitrogen，产品目录号为10829-018。

KnockOut^TM血清替代品（KOSR）购自Invitrogen,产品目录号为10828-028。

MEM非必须氨基酸,NEAA（100x）购自Gibco，产品目录号为11140-050。

GlutaMAX^TM-I（100x）购自Gibco，产品目录号为35050-038。

β巯基乙醇购自Sigma，产品目录号为M6205。

无钙镁离子的PBS购自WISENT，产品目录号为311-010-CL。

CD34microbead kit购自Miltenyi Biotec,产品目录号为130-046-702。

人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，产品目录号为 LTS1077-1。

STEMPRO-34购自Invitrogen，产品目录号为10639011。

重组人成纤维生长因子bFGF购自PeproTech,产品目录号为100-18B。

重组人干细胞因子SCF购自PeproTech,产品目录号为300-07。

重组人Flt3（Flt3）购自PeproTech,产品目录号为300-19。

重组人白细胞介素6（IL-6）购自PeproTech,产品目录号为200-06。

重组人白细胞介素3（IL-3）购自PeproTech,产品目录号为200-03。

重组人促血小板生成素（TPO）购自PeproTech,产品目录号为300-18。

二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma-Aldrich，产品目录号为D2650-100ML。

明胶购自Sigma-Aldrich，产品目录号为G1890-100G。

Matrigel购自BD，产品目录号为356231。

Stemfect^TMDNA转染试剂盒购自STEMGENT，产品目录号为00-0056。

Stemfect^TMRNA转染试剂盒购自STEMGENT，产品目录号为00-0069。

mMESSAGET3mRNA体外转录试剂盒购自Invitrogen，产品目录 号为1348。

ROCK抑制剂Y-27632购自R&D公司，产品目录号为1254。

Neon^TM电转染试剂盒购自Invitrogen，产品目录号为MPK1096。

限制性内切酶SfiI购自Fermentas，产品目录号为ER1821。

RiboLock^TMRNA酶抑制剂购自Fermentas，产品目录号为EO0381。

TURBO DNase购自Ambion，产品目录号为AM2238。

Tris饱和酚/氯仿溶液按照如下方法制备：将Tris饱和酚与氯仿按体积比 1：1混合得到。

Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen，产品目录号为11668-019。

0.25%胰酶/EDTA（50mL）按照如下方法配制：用PBS配制2.5g/100ml的胰酶储液， 0.2μm滤器过滤，用PBS配制10g/100ml的EDTA储液，高温灭菌。取5mL胰酶储液 和1mLEDTA储液，再用PBS定容至50mL，使其终浓度为0.25%胰酶/0.2%EDTA，即为 0.25%胰酶/EDTA。

0.05%胰酶/EDTA：将0.25%胰酶/EDTA用PBS稀释5倍即得。

3M DEPC-醋酸钠溶液（100ml）按照如下方法配制：称取40.8g醋酸钠固体，加入 40mL超纯水搅拌溶解。加入冰乙酸调节pH值至5.2，加入体积百分含量0.1%的DEPC， 定容至100mL，磁力搅拌器搅拌过夜，第二天高压蒸汽灭菌121℃，25分钟，冷却后 即可使用。

500ml成纤维细胞培养液、滋养细胞培养液按照如下方法配制：取440mLDMEM 培养基，加入50mL胎牛血清、5mL青霉素-链霉素双抗(终浓度为100U/ml,100 μg/ml)、5mL100x的GlutaMAX^TM-I（100x），4℃储存。

人类胚胎肾细胞293FT培养液按照如下方法配制：在成纤维细胞培养液的 基础上，每500mL培养液加入5mL NEAA（100x），4℃储存。

200ml人胚胎干细胞培养液按照如下方法配制：154mL KnockOut^TM-DMEM, 加入40mL KOSR，2mL GlutaMAX^TM-I（100x），2mL青霉素-链霉素双抗(100x)， 2mL NEAA(100x)，β巯基乙醇至终浓度1mM，用0.22微米孔径滤器过滤，最后 加bFGF至终浓度4ng/mL，4℃储存。

人脐带血CD34⁺造血干细胞培养液按照如下方法配制：4℃过夜融化其中的 StemPro-34Nutrient Supplement组分（购自Invitrogen公司），将其加入 STEMPRO-34培养基中，并加入GlutaMAX^TM-I至终浓度2mM。在使用前加入终浓 度如下的细胞因子：SCF50ng/ml，TPO50ng/ml，Flt350ng/ml，IL-310ng/ml, IL-610ng/ml。

实施例1、EBNA-D500mRNA的制备

一、体外转录模板的制备

利用限制性内切酶SfiI将pRN3P-EBNA-D500载体线性化，利用DNA纯化回收试剂 盒纯化酶切产物，以此作为EBNA-D500体外转录模板，可将其置于-80℃保存备用。

二、体外转录EBNA-D500mRNA

利用mMESSAGET3mRNA体外转录试剂盒，按照表1所示加入各组分， 37℃反应2小时，进行体外转录反应，得到EBNA-D500mRNA(SEQ ID No.2)。

表1体外转录体系

三、向体外转录体系中加入1μL TURBO DNase，37℃反应20分钟，消化DNA模 板。

四、用Microspin^TMS-200HR柱（购自GE公司，货号27-5120-01)，纯化步骤 三得到的mRNA产物。

五、加入与纯化的mRNA产物等体积的Tris饱和酚/氯仿溶液，上下充分颠倒混匀， 4℃12000rmp离心10分钟。

六、取出上清液（注意勿吸到中间白膜层），加入等体积的氯仿溶液，上下充分颠 倒混匀，4℃12000rmp离心10分钟。

七、取出上清液（注意勿吸到氯仿层），加入1/10体积的3M DEPC-醋酸钠溶液和 2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2小时以上。

八、4℃14000rpm离心20分钟，弃去上清，用体积百分含量为70%的乙醇洗涤mRNA。

九、4℃14000rpm离心10分钟，弃去上清，用体积百分含量为70%的乙醇洗涤mRNA。

十、4℃14000rpm离心10分钟，弃去上清，将mRNA干燥数分钟，待管内乙醇彻 底挥发后，加入适量分子生物学级别的水溶解，得到1μg/μL的EBNA-D500mRNA,分 装后将其保存于-80℃。

实施例2、在人胚胎肾细胞系293FT中化学共转染EBNA-D500mRNA和Episomal 质粒

Episomal质粒中文名为“非整合型附着体质粒”，即含有OriP/EBNA序列的质粒， 其中OriP为顺式结构，EBNA为反式结构，可作为任何哺乳动物细胞表达载体。

Episomal质粒和EBNA-D500突变体系统如图1所示。

pCEP4-EGFP和pCXLE-EGFP为两种不同的Episomal质粒。

具体步骤如下：

一、转染前一天将人胚胎肾细胞293FT传代到24孔板，细胞汇合度40-50%。

二、转染前两小时更换新鲜293FT细胞培养液。

三、根据Lipofectamine^TM2000说明书进行转染。脂质体与质粒的质量比为3:1。 实验组中，每孔分别加入0.5μg EBNA-D500mRNA和0.8μg pCEP4-EGFP、0.5μg EBNA-D500mRNA和0.8μg pCXLE-EGFP质粒、1.0μg EBNA-D500mRNA和0.8μg pCXLE-EGFP进行共转染，或单独加入0.8μg的Episomal质粒（pCXLE-EGFP质粒或 pCEP4-EGFP）单独转染，并以不加任何质粒的组为空白对照组。

四、根据Lipofectamine^TM2000说明书，转染6小时后换各组细胞的培养液。

五、通过荧光显微镜观察pCXLE-EGFP质粒单独转染组、0.5μg EBNA-D500mRNA 和0.8μg pCXLE-EGFP共转染组、pCEP4-EGFP质粒单独转染组、0.5μg EBNA-D500 mRNA和0.8μg pCEP4-EGFP共转染组细胞GFP的阳性率，并用流式细胞仪进行定量分 析。结果如图2A和2B所示。

图2A为pCEP4-EGFP单独转染、EBNA-D500mRNA和pCEP4-EGFP共转染人类胚胎 肾细胞293FT，转染后72h；

图2B为pCXLE-EGFP单独转染、EBNA-D500mRNA和pCXLE-EGFP共转染人类胚胎 肾细胞293FT，转染后72h；

图2A表明，与单独转染pCEP4-EGFP组(a)相比，EBNA-D500mRNA显著提高了GFP 表达细胞比例（b）；流式细胞检测显示，单独转染pCEP4-EGFP组有38％的细胞GFP 呈阳性(c)，而EBNA-D500mRNA和pCEP4-EGFP共转染组有46.5％的细胞GFP呈阳性 (d)。

图2B表明，EBNA-D500mRNA同样能显著增加pCXLE-EGFP在人类胚胎肾细胞293FT 中表达的效率，单独转染pCXLE-EGFP、EBNA-D500mRNA和pCXLE-EGFP共转染的GFP 阳性率分别为24.8%和36.2%。

取0.5μg EBNA-D500mRNA和0.8μg pCXLE-EGFP质粒共转染组、1.0μg EBNA-D500 mRNA和0.8μg pCXLE-EGFP共转染组、0.8μg pCXLE-EGFP单独转染组的细胞每隔3-5 天进行GFP阳性细胞流式分析，得到图2C。

图2C为EBNA-D500mRNA对pCXLE-EGFP质粒在细胞中表达时间的影响。

图2C表明，EBNA-D500mRNA和pCXLE-EGFP共转染18天后还有5％以上的细胞表 达GFP，而此时，无EBNA-D500mRNA的细胞只有约1％的细胞有GFP表达。

图2表明，EBNA-D500mRNA能显著增加Episomal质粒pCEP4-EGFP和pCXLE-EGFP 在人类胚胎肾细胞293FT中表达的效率和时间。

实施例3、在人类成纤维细胞中电转染EBNA-D500mRNA和Episomal质粒

一、转染前一天将人类成纤维细胞传代。

二、采用Invitrogen电转染仪,转染前设置好电转参数，参数为1550伏， 10毫秒，3次。

三、用0.25%胰酶/EDTA将人类成纤维细胞解离为单细胞，离心沉淀细胞，弃去培 养液，重悬细胞于PBS，计算细胞总数。

四、加入适当体积的电转液Buffer R（Neon^TM电转染试剂盒自带）重悬细胞， 调整细胞浓度为1x107/mL，在10μL的细胞中加入1μg EBNA-D500mRNA和0.5μg Episomal质粒（pCEP4-EGFP）或单独加入0.5μg Episomal质粒（pCEP4-EGFP），并 以不加任何质粒的组为空白对照组。

五、按照Neon^TM电转染试剂盒说明书，用Tip吸取各组的细胞混合悬液， 将各组混合液置于电击装置中，输入电转参数1550伏，10毫秒，3次，按下"Start" 按钮。

六、电击之后立即将各组转染后的细胞悬液转移至新鲜的成纤维细胞培养液中， 置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

七、转染后24小时换细胞培养液，在荧光显微镜下观察各组细胞的GFP的阳性 率。

结果如图3所示。

图3中，A：荧光显微镜观察EBNA-D500mRNA和pCEP4-EGFP共转染、 pCEP4-EGFP单独转染人类成纤维细胞。B：流式细胞仪检测EBNA-D500mRNA和 pCEP4-EGFP共转染、pCEP4-EGFP单独转染人类成纤维细胞和空白对照组细胞。 C：EBNA-D500mRNA和pCEP4-EGFP共转染、pCEP4-EGFP单独转染人类成纤维细 胞和空白对照组细胞的表达时间（a）和效率（b）。

图3中，pCEP4质粒代表pCEP4-EGFP质粒，EBNA-D500代表EBNA-D500mRNA。

图3A表明，相比于单独转染pCEP4-EGFP组，共转EBNA-D500mRNA和 pCEP4-EGFP组，EBNA-D500mRNA显著增加了GFP在人类成纤维细胞中的表达效 率。

图3B和3C表明，转染后第5天，与空白对照组和单独转染pCEP4-EGFP组 相比，共转EBNA-D500mRNA和pCEP4-EGFP组GFP阳性细胞比例以及平均荧光 强度显著增加。

图3表明，EBNA-D500mRNA能显著增加Episomal质粒pCEP4-EGFP在人类 成纤维细胞中表达的效率和时间。

实施例4、在人类胚胎干细胞系H9中化学共转染EBNA-D500mRNA和 pCXLE-EGFP质粒

一、转染前一天将人类胚胎干细胞H9传代至Matrigel上，密度约50％， 去除滋养细胞，在24孔板内进行转染。

二、按照Stemfect^TM转染试剂盒说明书的步骤操作。其中Stemfect^TMDNA 转染试剂盒中，polymer和质粒的比例为1：10；Stemfect^TMRNA转染试剂盒中， RNA转染试剂的量为2μg每孔。实验组中，每孔加入0.5μg EBNA-D500mRNA 和3μg pCXLE-EGFP质粒进行共转染，或加入3μg pCXLE-EGFP质粒单独转染。 阳性对照中加入3μg pCAG-EGFP单独转染，以不加任何质粒的组为空白对照组。

三、转染24小时后换细胞培养液，观察Episomal质粒（pCXLE-EGFP）的 表达情况，结果如图4所示。

图4中，A：转染后第3天，pCAG-EGFP单独转染、pCXLE-EGFP质粒单独转 染以及EBNA-D500mRNA和pCXLE-EGFP质粒共转染人类胚胎干细胞H9组的GFP 表达效率。B：H9细胞在拟胚体分化第8天pCAG-EGFP单独转染以及EBNA-D500 mRNA和pCXLE-EGFP质粒共转染人类胚胎干细胞H9组的GFP表达效率。

图4中，EBNA-D500代表EBNA-D500mRNA。

图4A表明，转染后第3天，相比于单独转染无OriP/EBNA序列的pCAG-EGFP 组（a、d和g）和单独转染pCXLE-EGFP组（b、e和h)，共转EBNA-D500mRNA 和pCXLE-EGFP组，EBNA-D500mRNA显著增加了GFP的在H9细胞中的表达效率 （c、f和i)。

图4B表明，共转染EBNA-D500mRNA和pCXLE-EGFP的H9细胞在拟胚体分 化后仍保持较强的GFP表达（d、f),而单独转染无OriP/EBNA序列的pCAG-EGFP 的H9细胞形成的拟胚体没有任何GFP表达（c、e)。

图4表明，EBNA1-D500mRNA能显著增加Episomal质粒pCXLE-EGFP在人类 胚胎干细胞H9中表达的效率和时间。

实施例5、在人类诱导多能干细胞MIFF中电转染EBNA-D500mRNA和 pCXLE-EGFP质粒

一、转染前将人类诱导多能干细胞MIFF在Matrigel上培养以去除滋养层 细胞。

二、利用Invitrogen的电转染人类诱导多能干细胞。

（一）电转染之前2小时将在Matrigel上培养的、无滋养细胞的诱导多能 干细胞MIFF进行换液,并在培养液中加入终浓度为20μm的ROCK抑制剂 （Y-27632）；设置好电转染仪中电转参数，电转参数为1050伏，20毫秒， 2次。

（二）弃去人类诱导多能干细胞培养液，加入PBS缓冲液清洗，而后加入 0.05%胰酶/EDTA，37℃孵育5分钟将人类诱导多能干细胞解离为单细胞。

（三）加入细胞培养液以终止胰酶反应，将细胞悬液转移到15mL离心管中， 1000rpm离心5分钟。

（四）弃去培养液，加入10mL PBS，计算细胞总数。

（五）加入适当体积的电转液Buffer R重悬细胞，调整细胞浓度为10⁷个 /mL。

（六）实验组中，在10μL的人类诱导多能干细胞中加入1μg的EBNA-D500 mRNA和0.5μg pCXLE-EGFP质粒共转染，或加入0.5μg的pCXLE-EGFP质粒单 独转染，阳性对照组中加入0.5μg pCAG-EGFP单独转染，共设三个转染组。

（七）按照说明，用Tip吸取各组细胞混合悬液，将其置于电击装 置中，输入电转参数1050伏，20毫秒，2次，按下"Start"按钮。

（八）电击之后立即将各组细胞悬液转移至滋养细胞上，用预热到37℃的 含有20μm的ROCK抑制剂（Y-27632）的人类胚胎干细胞培养液培养。

三、转染后第2天换液，在荧光显微镜下观察各组细胞的GFP的阳性率。

四、在长时间的培养过程中，挑取GFP的阳性克隆连续传代，观察记录GFP 在细胞中持续表达的时间。

结果如图5所示。

图5中，A：转染后第2天观察各组细胞GFP的表达；

B：转染后第6天观察各组细胞GFP的表达；

C：转染后第22天，观察EBNA-D500mRNA和pCXLE-EGFP质粒共转染组以 及的pCXLE-EGFP质粒单独转染组的GFP表达。

图5中，EBNA-D500代表EBNA-D500mRNA。

图5A表明，在MIFF细胞（人类诱导多能干细胞）中转染EGFP表达质粒， 转染后第2天各组均有GFP阳性细胞。

图5B表明，转染6天后，EBNA-D500mRNA和pCXLE-EGFP质粒共转染组(c、 f)的诱导MIFF细胞克隆GFP荧光亮度明显强于转染无OriP/EBNA序列的 pCAG-EGFP（a、d）和pCXLE-EGFP质粒单独转染组（b、e)。

图5C表明，转染22天后，相比pCXLE-EGFP质粒单独转染组（a、c），EBNA-D500 mRNA和pCXLE-EGFP质粒共转染组（b、d）仍旧持续表达较强的GFP荧光蛋白， 而转染无OriP/EBNA序列的pCAG-EGFP荧光基本不能被观察到。

按照上述实验方法，在10μL的人类诱导多能干细胞中加入0.25μg的 EBNA-D500mRNA和0.5μg pCXLE-EGFP质粒共转染，0.5μg的EBNA-D500mRNA 和0.5μg pCXLE-EGFP质粒共转染、0.75μg的EBNA-D500mRNA和0.5μg pCXLE-EGFP质粒共转染、或加入0.5μg的pCXLE-EGFP质粒单独转染，阳性对 照组中加入0.5μg pCAG-EGFP单独转染，不加任何质粒的组为空白对照组。

流式细胞仪检测在人类诱导多能干细胞MIFF化学转染后12天内GFP阳性 细胞的动态变化结果如图5D所示。

图5D中a表明，pCAG-EGFP对照组和单转pCXLE-EGFP组细胞中，GFP阳性 细胞所占比例递减很快，在第12天时已基本检测不到GFP阳性细胞，而分别共 转有0.25、0.5、0.75ug EBNA-D500mRNA和0.5μg pCXLE-EGFP质粒的细胞， 在第12天时平均有20%左右的细胞还表达GFP蛋白。

图5D中b表明，转染后第1天，共转有EBNA-D500mRNA组细胞的平均荧 光强度显著高于各质粒单转染组和空白对照组，在第12天时，共转有EBNA-D500 mRNA组细胞仍然有很强的平均荧光强度。

图5表明，EBNA-D500mRNA显著增加Episomal质粒pCXLE-EGFP在人类诱 导多能干细胞MIFF中表达的效率和时间。

实施例6、在人脐带血CD34⁺造血干细胞中电转染EBNA-D500mRNA和重编程质粒 （pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hUL和pCXLE-hSK）以制备诱导多能干细胞

一、脐带血CD34+造血干细胞的富集及培养

（一）利用人淋巴细胞分离液分离脐带血单个核细胞。

（二）分离得到的脐带血单个核细胞用CD34MicroBead Kit说明书分离其 中的CD34⁺造血干细胞。

（三）向预热的STEMPRO-34培养液中添加SCF、IL-3、IL-6、TPO和Flt3 五种细胞因子的组合，其中SCF的终浓度为50ng/ml,IL-3的终浓度为10ng/ml, IL-6的终浓度为10ng/ml,TPO的终浓度为50ng/ml,Flt3的终浓度为 50ng/ml，制成添加细胞因子的CD34⁺造血干细胞培养液，向其中接种脐带血CD34⁺造血干细胞，使细胞浓度为4x10⁵/mL。

（四）培养7天，期间换液时吸取一半的旧培养液，加入另一半新鲜培养 液，隔天换液。

二、脐带血CD34⁺造血干细胞的质粒电转染

（一）将脐带血CD34⁺造血干细胞转移到15ml离心管中，400g室温离心5 分钟，吸弃上清液。

（二）加入10ml预热的PBS重悬细胞，400g室温离心5分钟，吸弃上清 液。

（三）利用Invitrogen的进行电转染，加入适当体积的电转液Buffer R重悬细胞，调整细胞浓度至2x10⁷/ml。EBNA-D500mRNA和Episomal重编程质 粒共转染组为向10μL的细胞中加入0.5μg的EBNA-D500mRNA和各0.5μg episomal重编程质粒（pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hUL和pCXLE-hSK）共 转染，未加EBNA-D500mRNA组为向10μL的细胞中加入各0.5μg Episomal重 编程质粒（pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hUL和pCXLE-hSK）共转染、并以 加入0.5μg的pCAG-EGFP质粒单独转染作为阳性对照。

（四）按照说明，用Tip吸取各组细胞混合悬液，将其置于电击装 置中，输入电转参数1800伏，10微秒，3次，按下"Start"按钮。

（五）电击之后立即将各组细胞悬液转移至新鲜预热好的StemPro-34培养 液中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

（六）转染后第2天换液，在荧光显微镜下观察各组细胞的GFP的阳性率。

三、脐带血CD34⁺造血干细胞的重编程

（一）电转之后第2天将脐带血CD34+造血干细胞转移至滋养细胞包被的 平板里，接种密度为0.1x10⁶/cm²，此时撤除生长因子（即在STEMPRO-34不添加 任何上述的细胞因子）

（二）将步骤（一）的细胞培养至第6天，将培养基更换为新鲜的培养基 （该培养基由StemPro-34和人胚胎干细胞培养液组成，二者的体积比为1:1） 培养。

（三）第8天及以后换为人胚胎干细胞培养液持续培养，隔天更换一半旧 的培养液。

（四）培养14－21天后开始有初始诱导多能干细胞克隆出现，26天后将较 大的克隆挑出，放置于24孔板滋养细胞上继续培养传代。

（五）用倒置相差显微镜观察诱导多能干细胞克隆的形态。

（六）对诱导后第30天的诱导多能干细胞克隆固定及免疫荧光染色，观察 克隆的标志性蛋白的表达。

结果如图6所示。

图6中，A：重编程脐带血CD34⁺造血干细胞所用的培养液及对应的时间轴。

B：转染后24小时观察pCAG-EGFP转染组的GFP阳性细胞比例。a和b分别 为明场视野和荧光视野。

C：转染26天后，EBNA-D500mRNA和Episomal重编程质粒 （pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hUL和pCXLE-hSK）共转染组和未加 EBNA-D500mRNA组诱导多能干细胞克隆数目比较。

D：转染后各时期的诱导多能干细胞克隆形态。

E：诱导后第30天的诱导多能干细胞克隆固定及免疫荧光染色。依次为： 明场视野（a）、DAPI细胞核染色（b）、Oct4染色（c）、SSEA4染色（d）以及叠 加图（e）。

图6中，EBNA-D500代表EBNA-D500mRNA。

图6B表明，在脐带血CD34⁺造血干细胞中转染EGFP表达质粒pCAG-EGFP， 转染后第2天观察到有GFP阳性细胞。

图6C表明，转染26天后，EBNA-D500mRNA和Episomal重编程质粒共转 染组每1百万细胞产生80余个诱导多能干细胞克隆，约为未加EBNA-D500mRNA 组的10倍。

图6D中，a：电转染第2天后，脐带血CD34⁺造血干细胞在滋养细胞表面 生长的形态；b：电转染第14天后，初始诱导多能干细胞克隆出现；c：电转 染第26天，成熟诱导多能干细胞形态；d.将诱导多能干细胞单克隆分离培养6 天后，形成典型的诱导多能干细胞克隆。

重编程指将没有多能性的体细胞去分化，改变为胚胎干细胞样的、具有多种分化 潜能状态的细胞，又称诱导多潜能干细胞。

图6E表明，对诱导后第30天的诱导多能干细胞单克隆进行固定及免疫荧 光染色，结果表明该克隆高表达人类多能干细胞的标志性标记蛋白Oct4和 SSEA4，表明脐带血CD34⁺造血干细胞被成功重编程。

图6表明，EBNA-D500mRNA能显著增加体细胞的重编程效率。