小贯小绿叶蝉成虫总RNA的提取方法

摘要

本发明提供一种小贯小绿叶蝉成虫总RNA的提取方法，包括以下步骤：步骤1、将小贯小绿叶蝉成虫热激处理置于液氮中；步骤2、取出离心管加入总RNA提取液RNAisoPlus，匀浆；步骤3、将匀浆样品室温放置，离心；步骤4、吸取上清液，移入另一支离心管中；步骤5、向上清液中加入氯仿，室温静置、离心；步骤6、取出离心管，吸取上清液转入第三支离心管中，加入的异丙醇，静置、离心；步骤7、小心弃上清，加入乙醇，洗涤后离心，弃去乙醇，干燥，加入适量的RNase-free水得到高纯度的总RNA。本发明的提取方法简单有效，解决总RNA在提取过程中容易降解以及不容易高纯度提取总RNA的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种小型叶蝉类昆虫总RNA的提取方法，具体说是小贯小绿叶蝉成虫总RNA的提取方法。

背景技术

小贯小绿叶蝉 Empoasca onukii Matsuda 是一种世界性的茶树主要害虫，也是目前我国分布最广、为害最重的茶树害虫。近年来随着茶树种植面积的不断增加，该虫不断蔓延，严重影响了茶叶的产量和品质。被该虫为害后的芽叶在加工过程中易碎，产生烟焦味，成品茶条索松散，碎末增多，冲泡后汤色混浊，滋味苦涩，香气失常。一般的受害年份夏秋茶减产10%-15%，重灾年份减产达50%以上。不但给茶农造成了巨大的经济损失，而且严重地挫伤了广大茶农的生产积极性，已成为制约茶叶优质、高产的重要因素之一。

国内及世界其它主要产茶国家，如印度、斯里兰卡、越南、日本及非洲等国学者对小贯小绿叶蝉的人工饲养技术、生物生态学、综合防治技术及抗性等方面进行了比较全面系统的研究。但在高温下对其发生情况与生态学习性等方面的研究目前尚未见有人涉及。

小贯小绿叶蝉在我国的安徽、江苏、福建、广西、贵州等地，每年均有两次发生高峰，发生高峰受气候等因素影响明显。本项目组通过2010-2012年在信阳茶园对小绿叶蝉的发生情况进行监测，发现该地区每年仅10-11月份出现一次发生高峰，这与其他地区小贯小绿叶蝉的发生规律不同。研究发现，温度是影响其发生的关键因子，最高温度在35℃以上天数越多，小贯小绿叶蝉发生数量越少，不同年份随着高温出现时间的推迟，发生低峰期也随着推迟。而且温度是昆虫生长过程中的一个重要变量，温度变化对昆虫的发育、繁殖和存活会产生强烈的影响。

因此，研究高温胁迫下假眼小绿叶蝉的生长发育及分子适应机理，可以为准确预测预报其发生提供更多依据。研究表明，热激蛋白（Heat shock protein, Hsp）是动物在高于正常生长温度刺激下，诱导合成的新蛋白。能够防止蛋白质变性，使其恢复原有的空间构象和生物活性。目前学术界趋向于将热激蛋白分Hsp90、70、60、40和小Hsps（sHsps）家族。研究发现，热激蛋白不仅在生物体对环境适应性上起重要作用，很可能在昆虫正常生长发育中也起重要作用，这一研究结果进一步增加了人们对热激蛋白基因功能的了解，并为研究昆虫的生长发育提供了新的思路。目前，高温胁迫对小贯小绿叶蝉生长发育及热激蛋白表达的研究未见有人涉及，因此有必要研究高温对小贯小绿叶蝉抗逆性物质的影响及其热激蛋白的表达变化，从而为科学预测预报小贯小绿叶蝉的发生提供理论基础。

取得昆虫蛋白的经典方法是直接从昆虫中提取粗蛋白，然后通过聚丙烯酰氨凝胶电泳、凝胶层析离子交换柱等方法进行分离纯化得到昆虫蛋白，但是大部分昆虫很小，要分离纯化比较困难，且该过程比较繁琐。近年来，科学家们利用发展起来的分子生物学技术克隆得到蛋白的基因，再利用体外表达的方法获得足量目的蛋白，这从一定程度上缓解了研究目的蛋白的难度，但是该方法也必须先从昆虫中提取总RNA。对于较大的昆虫不难做到，可是像小贯小绿叶蝉这类小型而且擅长跳跃的叶蝉类昆虫却不是易事，如果没有一套完整有效的提取方法很容易使RNA降解也不容易得到符合要求的高纯度总RNA，使后续实验无法进行实施。

为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供了小贯小绿叶蝉成虫总RNA的提取方法，以解决现有技术中存在的像小贯小绿叶蝉成虫这类小昆虫的总R  NA提取不易以及纯度达不到要求的问题。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：小贯小绿叶蝉成虫总RNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1、收集小贯小绿叶蝉成虫于离心管中，将小贯小绿叶蝉成虫热激处理，使得小贯小绿叶蝉成虫热激昏迷，然后将所述离心管立即置于液氮中；

步骤2、从液氮中取出离心管并马上加入总RNA提取液RNAiso Plus，用塑料研磨棒充分匀浆后加入总RNA提取液RNAiso Plus至足量，然后用移液器对浆液吹打数次；

步骤3、将盛有足量总RNA提取液RNAiso Plus的匀浆样品室温放置5min，12000g，4℃离心5min；

步骤4、小心吸取上清液，将上清液移入另一支离心管中；

步骤5、向上清液中加入总RNA提取液的1/5体积的氯仿，盖紧离心管，剧烈震荡，待溶液充分乳化后，室温静置5min，12000g，4℃离心15 min；

步骤6、从离心机中取出离心管，吸取上清液转入第三支离心管中，向第三支离心管中加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒试管，充分混匀，在15-30℃的环境中静置10min，12000g，4℃离心10min，离心后试管底部出现沉淀；

步骤7、小心弃上清，慢慢沿离心管壁加入浓度为75%的乙醇，轻轻上下颠倒离心管，洗涤离心管壁，12000g，4℃离心5 min后弃去乙醇，室温干燥2-5 min，然后加入适量的RNase-free水来溶解沉淀，得到高纯度的总RNA。

基于上述，步骤1中小贯小绿叶蝉成虫热激处理的温度条件为34-36℃，热激处理时间为50-70 min。

基于上述，步骤5中向上清液中加入总RNA提取液的1/5体积的氯仿并盖紧离心管后，剧烈震荡的时间为15 s。

基于上述，各离心管均为1.5ml的离心管。

基于上述，步骤1中小贯小绿叶蝉成虫的数量为5头；步骤2中加入所述总RNA提取液RNAiso Plus的总量为1000ul，且先加入200ul充分匀浆后加入800ul；步骤5中加入200ul的氯仿；步骤6中加入700ul的异丙醇；步骤7加入浓度为75%的乙醇1ml，加入的RNASE-FREE水的量为15ul。

基于上述，步骤1中的热激处理在人工气候箱中且在光强4 000 lx，RH 60%±5%的光照条件下进行，在收集小贯小绿叶蝉成虫进入离心管中并移向所述人工气候箱中的过程中，将离心管口部朝下，利用小贯小绿叶蝉活动时向上的习性进行收集。

在步骤1中，热激处理前的所述离心管内放置新鲜茶叶芽头，并在热激处理之后将新鲜茶叶芽头取出，以创造接近于大田的生态环境。

本发明相对现有技术具有实质性特点和进步，具体的说，将小贯小绿叶蝉成虫热激昏迷，并立即置于液氮中，然后从液氮中取出离心管并加入少量总RNA提取液RNAiso Plus，用塑料研磨棒将其充分匀浆后加入总RNA提取液RNAiso Plus至足量，移液器吹打数次后然后按照总RNA提取方法提取总RNA，经氯仿抽提，异丙醇和乙醇沉淀分离得到高纯度的总RNA，提取方法简单有效，解决总RNA在提取过程中容易降解的问题，特别是在加入氯仿之前，先经过步骤3的离心和步骤4提取上清液，将底部的沉淀舍去，这些沉淀中含有大量的脂肪和大分子杂质，其中一些无法再后续步骤中除去，而通过步骤3和步骤4可将这些杂质先行除去，尽量减少杂质污染，为后续进一步的提纯，奠定基础，解决了高纯度提取总RNA的问题。

更进一步的，利用小贯小绿叶蝉成虫活动时向上的习性将小贯小绿叶蝉收集到离心管中，方便易操作。

更进一步的，在热激处理前的离心管内放置新鲜茶叶芽头，并在热激处理之后且所述离心管置于液氮中之前将新鲜茶叶芽头取出，目的是真实模拟小贯小绿叶蝉成虫的大田生态环境，使得试验得到的数据能够更有效地支持小贯小绿叶蝉成虫的防治研究中，另一方面，由于热激处理的时间比较长，为小贯小绿叶蝉成虫提供食物，防止小贯小绿叶蝉成虫因热激处理前期死亡等情况出现而影响试验结果的准确性。

附图说明

图1是小贯小绿叶蝉成虫总RNA完整性检测电泳图。

图2是小贯小绿叶蝉成虫总RNA反转录的cDNA模板对热激蛋白90基因PCR扩增结果的检测电泳图。

图3是小贯小绿叶蝉成虫总RNA反转录的cDNA模板对热激蛋白70基因PCR扩增结果的检测电泳图。

图4是小贯小绿叶蝉成虫总RNA反转录的cDNA模板对内参基因Actin PCR扩增结果的检测电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

小贯小绿叶蝉成虫总RNA的提取方法，包括以下步骤：

步骤1、收集小贯小绿叶蝉成虫于1.5 ml离心管中，将小贯小绿叶蝉成虫在34-36℃的温度条件下热激处理50-70 min，使得小贯小绿叶蝉成虫热激昏迷，然后将所述离心管立即置于液氮中；

步骤2、从液氮中取出离心管并马上加入总RNA提取液RNAiso Plus，用塑料研磨棒充分匀浆，呈无颗粒透明状，然后加入总RNA提取液RNAiso Plus至足量，然后用1 ml移液器对浆液吹打数次；

步骤3、将盛有足量总RNA提取液RNAiso Plus的匀浆样品室温放置5min，12000g，4℃离心5min；

步骤4、小心吸取上清液，将上清液移入另一支1.5ml离心管中，切勿吸取沉淀；

步骤5、向上清液中加入总RNA提取液的1/5体积的氯仿，盖紧离心管，剧烈震荡15 s，待溶液充分乳化后，室温静置5min，12000g，4℃离心15 min；

步骤6、从离心机中取出离心管，吸取上清液转入第三支离心管中，向第三支离心管中加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒试管，充分混匀，在15-30℃的环境中静置10min，12000g，4℃离心10min，离心后试管底部出现沉淀；

步骤7、小心弃上清，慢慢沿离心管壁加入浓度为75%的乙醇，轻轻上下颠倒离心管，洗涤离心管壁，12000g，4℃离心5 min后弃去乙醇，室温干燥2-5 min，然后加入适量的RNase-free水来溶解沉淀，得到高纯度的总RNA。

其中，步骤1中所述小贯小绿叶蝉成虫的数量为5头；步骤2中加入所述总RNA提取液RNAiso Plus的总量为1000ul，且先加入200ul充分匀浆后加入800ul；步骤5中加入200ul的氯仿；步骤6中加入700ul的异丙醇；步骤7加入浓度为75%的乙醇1ml，加入的RNASE-FREE水的量为15ul，上述数量的小贯小绿叶蝉成虫和试剂的用量以及配比，能在节省成本，降低试剂用量的情况下达到试验要求；另外，步骤1中的热激处理在人工气候箱中且在光强4 000 lx，RH 60%±5%的光照条件下进行，在收集小贯小绿叶蝉成虫进入离心管中并移向所述人工气候箱中的过程中，将离心管口部朝下，进行收集，由于小贯小绿叶蝉体型很小，四处跳跃，如果用常规的方法，很难将其在不受损伤的前提下移入离心管，技术人员通过细心的观察和琢磨，利用小贯小绿叶蝉活动时向上的习性将离心管管口向下，让其自己进入离心管中，操作非常方便，收集简单有效；在步骤1中，热激处理前的所述离心管内放置新鲜茶叶芽头，并在热激处理之后且所述离心管置于液氮中之前将新鲜茶叶芽头取出，目的是真实模拟小贯小绿叶蝉成虫的大田生态环境，使得试验得到的数据能够更有效地支持小贯小绿叶蝉成虫的防治研究中，另一方面，由于热激处理的时间比较长，为小贯小绿叶蝉成虫提供食物，防止小贯小绿叶蝉成虫因热激处理前期死亡等情况出现而影响试验结果的准确性。 

本实施例提取小贯小绿叶蝉成虫总RNA的方法简单有效，解决了总RNA在提取过程中容易降解的问题，特别是在加入氯仿之前，先经过步骤3的离心和步骤4提取上清液，将底部的沉淀舍去，这些沉淀中含有大量的脂肪和大分子杂质，其中一些无法再后续步骤中除去，而通过步骤3和步骤4可将这些杂质先行除去，尽量减少杂质污染，为后续进一步的提纯，奠定基础，解决了高纯度提取总RNA的问题。

得到高纯度的总RNA后，取少部分用于检测实验，其余于-80℃保存，或直接用于后续实验。

实验一

按照上述总RNA的提取方法进行提取试验，为了防止单个样本出现偶然性结果，本次提取选择了两个样本，均选择五头小贯小绿叶蝉成虫，得到的小贯小绿叶蝉虫成虫总RNA质量如表1所示：

表1 小贯小绿叶蝉成虫总RNA质量

处理的样本浓度（ng/ul）OD260/280OD260/230样本1301.61.991.32样本2295.81.981.30

电泳结果如下：

如图1所示，小贯小绿叶蝉成虫总RNA完整性检测电泳图，图中泳道为小贯小绿叶蝉成虫总RNA。

如图2所示，小贯小绿叶蝉成虫总RNA反转录的cDNA模板对热激蛋白90基因PCR扩增结果的检测电泳图，图中M为DNA LD2000 Marker，泳道为成虫总RNA反转录cDNA模板对小贯小绿叶蝉成虫热激蛋白基因90 PCR扩增结果。

如图3所示，小贯小绿叶蝉成虫总RNA反转录的cDNA模板对热激蛋白70基因PCR扩增结果的检测电泳图，图中M为DNA LD2000 Marker，泳道为成虫总RNA反转录cDNA模板对小贯小绿叶蝉成虫热激蛋白基因70 PCR扩增结果。

如图4所示，小贯小绿叶蝉成虫总RNA反转录的cDNA模板对内参基因Actin PCR扩增结果的检测电泳图，图中M为DNA LD2000 Marker，泳道为成虫总RNA反转录cDNA模板对小贯小绿叶蝉成虫Actin 基因PCR扩增结果。

实验二

将其中一个样本完全按照上述总RNA的提取方法进行提取，另一个样本的提取方法的区别仅在于缺少上述总RNA的提取方法中的步骤3和步骤4，检测结果发现，各电泳图条带非常模糊，整个屏幕几乎全黑，未显示清晰泳道，说明缺少步骤3和步骤4这两个步骤的时候，无法提取出符合要求的高纯度总RNA。

实验三

其中一个样本完全按照上述总RNA的提取方法进行提取，另一个样本的的提取方法的区别仅在于热激处理前的所述离心管内未放置新鲜茶叶芽头，检测结果发现，各电泳图条带清晰度降低，泳道出现少许模糊，说明离心管内未放置新鲜茶叶芽头时候，对提取总RNA产生不利影响。

最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。