公开/公告号CN103655838A
专利类型发明专利
公开/公告日2014-03-26
原文格式PDF
申请/专利权人 山东中大药业有限公司;
申请/专利号CN201310669829.6
申请日2013-12-11
分类号A61K36/752(20060101);A61P1/14(20060101);A61P25/20(20060101);A61P35/00(20060101);
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代理人
地址 250062 山东省济南市历下区经十路16369号
入库时间 2024-02-19 22:10:12
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-12-06
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K36/752 授权公告日:20150624 终止日期:20181211 申请日:20131211
专利权的终止
2015-12-30
专利权的转移 IPC(主分类):A61K36/752 登记生效日:20151211 变更前: 变更后: 申请日:20131211
专利申请权、专利权的转移
2015-06-24
授权
授权
2015-06-03
著录事项变更 IPC(主分类):A61K36/752 变更前: 变更后: 申请日:20131211
著录事项变更
2015-06-03
专利申请权的转移 IPC(主分类):A61K36/752 变更前: 变更后: 登记生效日:20150515 申请日:20131211
专利申请权、专利权的转移
2014-04-23
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K36/752 申请日:20131211
实质审查的生效
2014-03-26
公开
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技术领域
本发明属于中药技术领域,具体涉及一种益康补元片的制备方法及其在抑制小鼠淋巴瘤细胞L5178Y细胞增殖药物中的应用。
背景技术
益康补元颗粒标准号WS-10983(ZD-0983)-2002,记载于国家中成药标准汇编内科脾胃分册。由黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g作为原料药制成,具有益气活血,健脾补肾的功效。用于气虚血瘀、脾肾亏虚引起的神疲乏力,呼吸气短,失眠,腰膝酸软,食少健忘等症。
现有技术中,尚未有益康补元颗粒在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道,而挥发油提取,水煎煮的方法,工艺粗糙、落后,杂质多,导致患者用量过大,不方便服用,严重影响了本品在临床上应用。
发明内容
为了解决上述的技术问题,本发明提供了一种益康补元片的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞L5178Y细胞增殖药物中的应用。
本发明的目的是通过如下的方案实现的:
一种益康补元片的制备方法,由黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g作为原料药制成,所述的制备方法由下列步骤组成:取麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%,萃取压力15-30MPa,温度30-50℃,CO2流量l-3ml/g生药·min,萃取时间180-220min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率600-800W,萃取2次,每次5-10分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒, 干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中萃取压力为25MPa。
上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中萃取温度为60℃。
上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中CO2流量2ml/g生药·min。
上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中萃取时间为200min。
上述的益康补元片的制备方法中,所述微波萃取功率为700W。
上述的益康补元片的制备方法中,所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
上述的益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞L5178Y细胞增殖药物中的应用。
现有技术中,益康补元颗粒每次1袋,每袋7g,一日3次。益康补元颗粒服药量大,且颗粒剂制备需要加大量的糖,糖尿病患者不适宜,不加糖的话味道不佳,患者不容易服下,依从性差。采用本发明方法制备成的益康补元片每片重0.3g,每次仅需2片,一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂,患者随水吞下即可,服药量小且无苦味,患者易于接受。
试验一、不同方法制备的益康补元片中芍药苷含量的比较
l、仪器及试药本发明益康补元片:按实施例1方法制备,使用1510g原料药,经提取制成300片,每片重0.3g。原益康补元颗粒,按照WS-10983(ZD-0983)-2002标准方法制备。Agilent1200高效液相色谱仪;METTLER AE240电子分析天平;芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所)。
2、方法
照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录V D)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-0.2%磷酸水溶液(15∶85)为流动相;检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥36小时的芍药苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,即得。
本发明产品供试品溶液的制备取本发明的益康补元片,研细,取2.25g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml.密塞,称定重量,超声处理(功率250w.频率 33kHz)1小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
对照产品供试品溶液的制备取本对照的益康补元颗粒,研细,取2.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml.密塞,称定重量,超声处理(功率250w.频率33kHz)1小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
3、结果
结果表明,本发明益康补元片中芍药苷的含量为5-8mg/片;而原益康补元颗粒中芍药苷的含量为4.8mg/袋,每次服用量2片的芍药苷含量为原颗粒剂含量的2-4倍,在服用量减少的情况下,芍药苷含量有很大提高。
上述研究表明,采用本发明制备方法制备的益康补元片,有效成分含量远远高于WS-10983(ZD-0983)-2002标准记载的方法制备的益康补元颗粒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明,以便本领域的技术人员更了解本发明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,萃取压力25MPa,温度40℃,CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间200min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率700W,萃取2次,每次8分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
经检测,成品中芍药苷的含量为7.8mg/片。
实施例2
取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%,萃取压力30MPa,温度50℃,CO2流量3ml/g生药·min,萃取时间180min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率600W,萃取2次,每次5分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
经检测,成品中芍药苷的含量为5.6mg/片。
实施例3
取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%,萃取压力15MPa,温度30℃,CO2流量1ml/g生药·min,萃取时间220min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率800W,萃取2次,每次10分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
经检测,成品中芍药苷的含量为6.2mg/片。
实施例4:益康补元片抑制小鼠淋巴瘤细胞L5178Y细胞增殖的实验研究资料
1.实验材料
1.1实验用细胞株
小鼠淋巴瘤细胞L5178Y细胞,山东大学实验室细胞库,DMEM+10%FBS常规培养。
1.2实验药物
研究药物:本发明益康补元片:按实施例1方法制备。
药液储液:称取100mg益康补元片,溶于5ml无水乙醇中,0.2μm滤器过滤, 500μldoff管分装,-20℃存储,同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
1.3实验试剂
DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419);NaHCO3(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387);Trypsin(AMRESCO公司);EDTA(AMRESCO公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司1);Streptomycin Sulfate(AMRESCO);无水乙醇(淄博亚杜兰经贸有限公司);MTT(Biosharp批号:0793):PBS(实验室自配);
1.4实验器材
莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190);CO2培养箱(FORMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号:SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Sprlng公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:KA-1000);0.2μm滤器(MILLIPORE型号:SLGP033RB);1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司);细胞计数板;离心管、移液管、Tips若干。
2.实验方法
1)L5178Y细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养(10cm培养皿),当细胞生长至对数期时,收集细胞,弃去培养液,PBS轻洗3遍,加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37℃消化2min后,向其中加入5ml完全培养基中和反应,吹打细胞后将其转入离心管中,1000rpm离心5min,调整细胞悬液浓度3×104个/ml。
2)将细胞种入96孔培养板中,每孔加入细胞悬液180μl,培养板放入细胞培养箱中(37℃,5%CO2)常规培养。
3)根据细胞生长情况,一般长至50%-70%,加入益康补元片溶液,继续培养24h。
4)24h后加入20μl MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。
5)4h后扣板法倒去上清,用吸水纸轻轻拍干,每孔如入200μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
6)同时设置本底(不加细胞,只加培养液),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定6个复孔。
7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)、对照孔OD值×100%。实验重复3次。
3.统计处理
采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验,数据以mean±S.D.表示。
4.实验结果
MTT法实验后统计结果显示,与对照组比较,当剂量达到5mg/ml时,对L5178Y细胞增殖抑制有差异(P<0.05),剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01),当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。
表1益康补元片对L5178Y细胞增殖抑制影响研究(X±SD)
注:与对照组比较,*P<O.01;**P<0.001。
5.实验结论
本发明的益康补元片可以抑制L5178Y细胞增殖,减少L5178Y细胞的细胞生长数目,该作用呈剂量依赖性。
机译: 抑制b细胞肿瘤细胞增殖,治疗患有肿瘤的患者,治疗患有taki信号转导分子失调的患者,抑制实体瘤生长,选择具有治疗可持续性的肿瘤的方法使用taki抑制剂来抑制细胞白血病和t细胞淋巴瘤的增殖,并选择具有抑制b细胞肿瘤细胞增殖的哺乳动物或方法,以治疗患有肿瘤的患者,以治疗患有t细胞淋巴瘤的患者失调的tak1信号转导分子,以抑制实体瘤的生长,选择患有对tak1抑制剂治疗敏感的肿瘤的患者,以抑制细胞白血病和t细胞淋巴瘤的增殖,并选择患有或怀疑患有肿瘤的哺乳动物可使用tak1抑制剂治疗
机译: 分离纯化DNA,肽,人和鼠sphk2的氨基酸序列,重组DNA的构建,宿主细胞。小鼠和人2型鞘氨醇激酶2型亚型的肽的制备方法,并检测抑制或促进2型鞘氨醇激酶活性的药物或药物,药物或产物的调节方法,用于治疗哺乳动物的生物学过程的方法,用于治疗或改善由细胞死亡引起的疾病的方法,增加或减少的细胞增殖用于治疗或管理由减少的细胞死亡或细胞增殖引起的疾病,以及用于治疗或改善由癌症,再狭窄和糖尿病性神经病变组成的组中的细胞异常迁移或运动导致的疾病。用于治疗或改善由细胞死亡引起的UIMA疾病的组合物可增加或减少细胞增殖。
机译: 免疫缀合物,用于在个体中治疗多发性骨髓瘤的方法,用于分配免疫缀合物介导的药物,用于在需要其的患者中抑制,延迟和/或预防肿瘤的发展和/或分配恶性肿瘤细胞,用于治疗患有以下疾病的个体:为了减少与免疫缀合物直接或间接接触的细胞数量,一种用于治疗个体多发性骨髓瘤,分配免疫缀合物介导的药物,抑制,延迟和/或预防细胞培养中肿瘤细胞发展,抑制,在有需要的患者中延迟和/或预防肿瘤的发展和/或分配恶性肿瘤细胞,以治疗患有某种疾病的个体并减少直接或间接接触的细胞数量。带有肿瘤细胞,药物成分和试剂盒。