一种检测重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法

摘要

本发明公开了一种检测重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法。采用改良鲎试剂检查法，用2ml细菌内毒素检查用水溶解重组猪干扰素α1冻干粉针剂，100℃煮沸10min去除鲎试验干扰因素，用细菌内毒素检查用水在不超过最大有效倍数的情况下对煮沸处理后重组猪干扰素α1蛋白进行逐级稀释，先检查各稀释浓度的细菌内毒素含量，然后再从反应结果为阴性的最低稀释度开始做干扰试验，找出在无干扰的情况下能与鲎试验形成凝胶的最低浓度，从而确定重组猪干扰素α1冻干粉针剂中内毒素的具体含量。本发明为重组猪干扰素α1冻干粉针剂生产应用提供了测定细菌内毒素的测定方法。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种生物制品的细菌内毒素含量检测方法，具 体涉及一种重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的检测方法。

背景技术

干扰素作为当前公认的抗病毒有效药物，安全性能好，并具有良好的抗病毒 及免疫调节功能，是当今应用前景最为广泛的生物制剂之一。动物用干扰素最早 应用于兽医临床的是猪白细胞干扰素，但该种干扰素表达量低，需采用生化分离 的方法获得，成本较高，不利于规模化生产。我室采用基因工程技术获得了一种 重组猪干扰素ɑ（重组猪α干扰素的制备方法，专利号2008100201804），临床试用 结果表明其可有效治疗猪病毒性腹泻等疾病。

细菌内毒素是一种革兰阴性细菌细胞壁的组成成分，只有在细菌死亡或繁殖 时，才释放到细胞外，发挥各种效应。内毒素化学本质为脂多糖（LPS）。细菌 内毒素检查法是近二十年来发展起来的用于检测药品及其中间品中内毒素污染 的一种方法。传统的细菌内毒素检查法是家兔热原检查。2005年版《中国药典》 参照美、欧、日三方关于细菌内毒素检查法协调案的格式,并结合国内实际情况, 确定了鲎试验法做为检测人基因工程干扰素制剂细菌内毒素含量的标准检测方 法。本法与传统家兔法比较具有灵敏度高，无个体差异，受外界影响小，实验重 现性好，费用低廉等优点，非常适合厂家对生产全过程的热原监控和中间产品检 测。但是目前兽用生物制品现行的细菌内毒素检查法依然是传统的家兔热原检 查，因此建立兽用生物制品中新的细菌内毒素含量检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明目的就是提供一种重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的 检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测重组猪干扰素α1冻干粉针剂中细菌内毒素含量的方法，采用改良 鲎试剂检查法，包括以下步骤：

用2ml细菌内毒素检查用水溶解重组猪干扰素α1冻干粉针剂，100℃煮沸 10min去除鲎试验干扰因素，用细菌内毒素检查用水在不超过最大有效倍数的情 况下对煮沸处理后重组猪干扰素α1蛋白进行逐级稀释，先检查各稀释浓度的细 菌内毒素含量，然后再从反应结果为阴性的最低稀释度开始做干扰试验，找出在 无干扰的情况下能与鲎试验形成凝胶的最低浓度，从而确定重组猪干扰素α1冻 干粉针剂中内毒素的具体含量。

本发明的优点是：

可以快速地检测出重组猪干扰素α1冻干粉针剂中的细菌内毒素含量。

采用加热法去除了干扰因素，检测结果准确可靠。

操作简便，无需贵重精密的大型的设备，检测成本低。

具体实施方式

实施例1

1.试剂

供试品：重组猪干扰素α1冻干粉针剂（批号是20121116，效价为1.0×10⁶IU， 内毒素含量为25EU）

细菌内毒素检查用水：内毒素含量小于0.015EU/ml且对内毒素试验无干扰作 用的灭菌注射用水

细菌内毒素国家标准品：购自中国食品药品检定研究院，每支10000EU。

鲎试剂：购自厦门鲎试剂厂，0.1ml/支（λ=0.25EU/ml）

2.仪器设备

旋涡混合器、封口膜、试管（10×75mm）、吸管、镊子（金属）、金属盒。

实验中使用的所有玻璃器具一般经洗液浸泡后，取出用自来水、纯化水依 次冲洗干净（可用纯化水浸泡）。

试验中所用的器皿，需要经过250℃干烤30分钟以上备用，以除去外源性内 毒素。除去外源性内毒素的玻璃器皿应在规定内使用（如果玻璃器皿用锡箔纸包 装，在不打开包装的情况下可在两周内使用），否则须再次除去可能存在的外源 性内毒素。

3.确定细菌内毒素限值

公式L=K/M计算。M为每公斤每小时临床最大用药剂量，依据药品使用说明 书确定，注射时间若不足1小时，按1小时计算。K为每公斤体重每小时最大可 接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5EU/(kg·h)

本室重组猪干扰素α1冻干粉针剂按效价计算：每公斤每小时临床最大用重 组猪干扰素α1冻干粉针剂剂量1000IU（20公斤乳猪20000IU干扰素），L为 5EU/2000IU=0.0025EU/IU，每支重组猪干扰素α冻干成品20000IU，则每支重 组猪干扰素α1冻干粉针剂内毒素限值为50EU。

4.确定最大有效稀释倍数（MVD）

最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数 （MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来 确定MVD：MVD=cL/λ

其中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，λ为在凝胶法中 鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低 的内毒素浓度。

本室重组猪干扰素α1冻干粉针剂：c=10000IU/ml，L为0.0025EU/IU，λ为 0.25EU/ml，MVD=100。

5.鲎试剂灵敏度复核试验

在本检查法规定的条件下使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试 剂的标示灵敏度，用EU/ml标示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何 可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工 作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、 λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步应在漩涡混合器上混匀 30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格 的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每 一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对 照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温 60分钟±2分钟。

当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性， 试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测 定值（λc）。

λc=lg-1（∑X/4）

式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒 素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

需要注意的是，当实测灵敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试 剂灵敏的标示值）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试 剂的灵敏度（结果见表1）。

6.干扰试验预试验

取一支重组猪干扰素α1冻干粉针剂，然后用2ml细菌内毒素检查用水溶解后 作为原液。按照拟定内毒素限值，加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD 规定的系列稀释度：1:10、1:20、1:40、1:80、1:100，再分别将每个稀释度制成 含有和不含有2λ细菌内毒素标准品的重组猪干扰素α1溶液。同时设立阳性对照 (加入2λ的标准内毒素)及阴性对照(细菌内毒素检查用水)，其中每个稀释度平行 做两支，计算平均回收率。

重组猪干扰素α1原液1:20、1:40、1:80、1:100稀释外加2λ细菌内毒素标准品 后，细菌内毒素检测回收率均在有效范围50%～200%内，表明重组猪干扰素α1冻 干粉针剂在该实验条件下已能排除干扰因素。正式干扰实验选用1:20稀释度。

7.干扰试验

重组猪干扰素α1原液1:20稀释，按表2制备各系列溶液。参照鲎试剂灵敏度 复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。

结果观察与判断：

只有当重组猪干扰素α1溶液（A）和阴性对照溶液（D）的平行管都为阴性， 且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为 有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终 点浓度的几何平均值(Es和Et)。当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～ 2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若重组猪干扰 素α1溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将重组猪干扰素α1溶液进 行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。本实验结果表明重组猪干扰素α1 原液1:20稀释对鲎试剂检测无干扰。

当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查 法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中 发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

8.细菌内毒素检测

取重组猪干扰素α1冻干粉针剂，然后用2ml细菌内毒素检查用水溶解后作为 原液，在涡旋振动器上使其完全溶解。取鲎试剂，每支加入0.1ml细菌内毒素检 测用水溶解，从中取1支加入0.1ml2λ的细菌内毒素标准品作为阳性对照，1支加 入0.1ml细菌内毒素检测用水作为阴性对照，其余每4支作平行加入各稀释度的重 组猪干扰素α1溶液0.1ml。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃ 的恒温器中，保温60±2min后观察结果。

9.结果判定

在重组猪干扰素α1溶液形成凝胶的最大稀释倍数且无干扰的情况下，计算重 组猪干扰素α1冻干粉针剂中内毒素含量。

重组猪干扰素α1冻干粉针剂中内毒素浓度=鲎试剂的灵敏度×所有平行管反 应终点浓度的几何平均值。

表1标示灵敏度0.25EU/ml的鲎试剂灵敏度复核实验

表2凝胶法干扰试验溶液的制备