杜仲中灰毡毛忍冬素G的制备及在神经保护药物中的应用

摘要

本发明属于树木次生代谢活性成分及天然药物技术领域，具体涉及一种以药用树种杜仲为原料制备灰毡毛忍冬素G的方法及灰毡毛忍冬素G在制备神经保护药物中的用途。本发明以杜仲树植物材料为原料，经提取、萃取、分离而得到灰毡毛忍冬素G。本发明的制备工艺简单、成本低、周期短、得率高。试验证实灰毡毛忍冬素G对模型细胞损伤起到了显著的保护作用，表明灰毡毛忍冬素G可用于制备神经保护作用药物，以预防及治疗各种神经退行疾病。

说明书

技术领域

本发明属于树木次生代谢活性成分及天然药物技术领域，具体涉及一种以药用树种杜仲 为原料制备灰毡毛忍冬素G的方法及灰毡毛忍冬素G在制备神经保护药物中的应用。

背景技术

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属(Eucommia)植物， 落叶乔木，树高可达20余米。药用杜仲为杜仲的干燥树皮，质脆，比较容易折断，折断后有 细密、白色、富有弹性的银丝，是中国特有的贵重中药材和提取胶原料的中药材(叶文峰，林 产化工通讯，2004，38(5)，40～44)，中国药典规定杜仲树皮作为中药杜仲入药。杜仲是国家二 级珍稀树种，由于其起源古老，在科学上具有极其重要的研究价值和药用价值。在我国，杜 仲起源于陕、川、甘三省交界的秦岭山脉，主要分布于四川、云南、贵州、湖北、湖南、河 南、安徽、江西等省和自治区(汤诗杰等，林业科技开发，2007，21(2)，8～12；Yao LN，et al， Holzforschung，2010，64(5)，571～575；Xu ZS，et al，Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2010，58(12)，7289～7296)。《神农本草经》和《本草纲目》中记载杜仲树材料入药后性味甘、 味辛、温、无毒，有补肝肾、益腰酸、强志、安胎、久服耐劳轻身等功效，可用于肾虚腰痛， 筋骨无力，妊娠漏血等症。现代医学证明杜仲树材料具有双向调节血压、增强细胞免疫功能 和非特异性免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降低血糖、调节血脂等多方面的 功效(辛晓明等，医学综述，2007，13(19)，1507～1509；Jin X，et al，Journal ofEthnopharmacology， 2010，128(3)，672～678；Luo XB，et al，Journal of Liquid Chromatography and Related  Technologies，2004，27(1)，63～81；Luo XF，et al，Journal of Ethnopharmacology，2010，129(2)， 238～243；Matsuda E，et al，Journal of Natural Medicines，2006，60(2)，126～129；Kwon SH，et al， Neuroscience Letters，2011，487(1)，123～127)。最新医学研究证实杜仲树材料提取物入药可对神 经细胞起到较好的保护作用(彭红梅等，中医学报，2013，28(1)，72～73)。

灰毡毛忍冬素G，英文名为macranthoin G，化学名为3，4-O-双咖啡酸基奎尼酸甲醋(methyl 3，4-O-dicaffeoylquinate)，分子式为C₂₆H₂₆O₁₂。灰毡毛忍冬素G是一种微黄色粉末，熔点 123～124℃，三氯化铁显色反应呈阳性(暗绿色)，紫外灯下观察显兰色荧光。灰毡毛忍冬素 G最先从灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz)花蕾中提取分离得到(陈敏等，药 学学报，1994，29(8)，617～620)，现发现灰毡毛忍冬素G也存在于灯盏细辛(Erigeron breviscapus (Van.)Hand.-Mazz)及忍冬藤(Lonicerajaponica Thunb)等植物中(岳建民等，植物学报，2000， 42(3)，311-315；张聪等，中国中药杂志，2009，34(23)，3051-3053)。但至今为止，尚无文献报 道杜仲树植物材料中含有灰毡毛忍冬素G成分。

最新研究表明，灰毡毛忍冬素G的抗氧化作用明显，是非常好的自由基消除剂(Kim，et al， Food Chemistry，2011，125(1)，55-62；Choi，et al，Archives of Pharmacal Research，2004，27(2)， 164-168)。而且，在生物活性评价实验中，灰毡毛忍冬素G显示了非常显著的对体外NK细胞 的激活效果，未见任何抗血小板聚集的活性(陈敏等，药学学报，1994，29(8)，617～620)。但 迄今为止，尚未见灰毡毛忍冬素G单体成分防治任何神经退行疾病活性的研究报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种操作工艺简单、短周期、低成本、高得率地从杜仲树植物 原料中制备灰毡毛忍冬素G的方法。

本发明的另一个目的是提供灰毡毛忍冬素G在制备神经保护药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

从杜仲树植物原料中制备灰毡毛忍冬素G的方法，包括如下步骤：

(1)取粉碎的杜仲树植物原料，按质量比为1：1～1：25加入体积百分浓度为1％～99％ 的乙醇水溶液，常温或加热或超声波提取1～6次，每次1～48小时，过滤，滤液减压浓缩至 原体积的1％～20％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量1～6倍的水，搅拌，加入粗提物质量1～10倍的正己烷萃取1～6 次，分离，将剩余水层加入粗提物质量1～10倍的二氯甲烷萃取1～6次，分离，将再次剩余 的水层加入粗提物质量1～10倍的乙酸乙酯萃取1～6次，分离乙酸乙酯层和最后的水层，将 乙酸乙酯层减压浓缩得乙酸乙酯萃取相；

(3)乙酸乙酯萃取相经凝胶色谱柱层析和硅胶色谱柱层析之至少一种制备得到灰毡毛忍 冬素G。

在上述灰毡毛忍冬素G的制备步骤中，所述杜仲树植物原料包括杜仲树的树干、树枝、 树叶、树根、树皮、根皮、木质部中的一种或几种。

灰毡毛忍冬素G在制备神经保护药物中的应用：

实验结果显示，灰毡毛忍冬素G预处理能显著降低H₂O₂诱导的PC12细胞的MDA水平、 能显著增加SOD水平及增加过氧化氢酶活性、能明显降低H₂O₂诱导PC12细胞内的活性氧 的产生、可以拮抗H₂O₂诱导的PC12细胞的损伤，提高了细胞的存活率，说明灰毡毛忍冬素 G对PC12细胞损伤起到了较好的保护作用。结果表明灰毡毛忍冬素G可用于制备神经保护 作用药物，以预防及治疗各种神经退行疾病。

附图说明

图1为灰毡毛忍冬素G对正常PC12细胞存活率的影响。

图2为灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导的PC12细胞存活率的影响。

图3为灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导的PC12细胞MDA水平的影响。

图4为灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导的PC12细胞SOD活性的影响。

图5为灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导的PC12细胞过氧化氢酶活性的影响。

图6为灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导的PC12细胞内活性氧积累的影响。

具体实施方式

参考下列实施例将更容易、更全面地理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不 是以任何方式限制本发明。

实施例1：

灰毡毛忍冬素G的制备

(1)取粉碎的杜仲树根皮为原料，按质量比为1：5加入体积百分浓度为95％的乙醇水 溶液，常温提取3次，每次12小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的3％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量2倍的水，搅拌，加入粗提物质量3倍的正己烷萃取3次，分离， 将剩余水层加入粗提物质量3倍的二氯甲烷萃取3次，分离，将再次剩余的水层加入粗提物 质量3倍的乙酸乙酯萃取3次，分离乙酸乙酯层和最后的水层，将乙酸乙酯层减压浓缩得乙 酸乙酯萃取相；

(3)乙酸乙酯萃取相经凝胶色谱柱层析制备得到灰毡毛忍冬素G。

实施例2：

灰毡毛忍冬素G的制备

(1)取粉碎的杜仲树木质部为原料，按质量比为1：10加入体积百分浓度为80％的乙醇 水溶液，加热提取5次，每次6小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的5％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量3倍的水，搅拌，加入粗提物质量4倍的正己烷萃取4次，分离， 将剩余水层加入粗提物质量4倍的二氯甲烷萃取4次，分离，将再次剩余的水层加入粗提物 质量4倍的乙酸乙酯萃取4次，分离乙酸乙酯层和最后的水层，将乙酸乙酯层减压浓缩得乙 酸乙酯萃取相；

(3)乙酸乙酯萃取相经硅胶色谱柱层析制备得到灰毡毛忍冬素G。

实施例3：

灰毡毛忍冬素G对过氧化氢H₂O₂诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)氧化应 激损伤的保护作用

(1)PC12细胞的培育

PC12细胞在含有5％FBS、10％HS、100U／ml青霉素及100μg／ml链霉素的RPMI1640 培养基中于37℃下5％浓度的CO₂孵箱中培养。

(2)灰毡毛忍冬素G对正常PC12细胞存活率的影响

以MTT法测定以不同浓度(0、3.125、6.25、12.5、25及50μM)灰毡毛忍冬素G处理24h 后的PC12细胞的存活率。其结果如图1所示，相比于未经灰毡毛忍冬素G处理的对比组，各组 PC12细胞的相对存活率几乎为100％，即灰毡毛忍冬素G对H₂O₂未诱导的正常PC12细胞几乎没 有毒性影响。

(3)灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导的PC12细胞存活率的影响

以不同浓度(0、6.25、12.5、25及50μM)的灰毡毛忍冬素G处理PC12细胞30min，然后 用0.75mM H₂O₂诱导6h。以MTT法判断灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导PC12细胞损伤的保护活性， 其存活率如图2所示。结果表明，相比于对比组(灰毡毛忍冬素G和H₂O₂处理的PC12细胞组)， 用0.75mM H₂O₂诱导6h后，PC12细胞存活率下降到26.6％，而在6.25，12.5，25及50μM的灰毡毛 忍冬素G保护下，PC12细胞存活率分别升高到34.0％、52.4％、68.3％及82.0％，即灰毡毛忍冬 素G预处理可以拮抗H₂O₂诱导的PC12细胞的损伤，提高细胞的存活率。

(4)灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导PC12细胞内MDA水平、SOD活性及过氧化氢酶活性的 影响

将PC12细胞按每孔6×10⁵个细胞接种到6孔培养板上以4ml培养基孵育16h，再以不同浓度 (0、6.25、12.5、25及50μM)的灰毡毛忍冬素G处理后继续培养30min，再以0.75mM H₂O₂诱导6h。然后以分光光度法确定PC12细胞的MDA水平、SOD活性和过氧化氢酶活性，试验结 果如图3、图4、图5所示。结果表明，随着浓度的增加，灰毡毛忍冬素G能显著降低H₂O₂诱导 的PC12细胞的MDA水平，可以显著增加SOD及过氧化氢酶活性，即灰毡毛忍冬素G预处理可 以明显的抑制过氧化氢诱导PC12细胞的损伤。

(5)灰毡毛忍冬素G对H₂O₂诱导的PC12细胞内活性氧积累的影响

将PC12细胞按每孔1×10⁵个细胞接种到6孔培养板上以2ml培养基孵育16h，再以不同浓度 (0、25及50μM)的灰毡毛忍冬素G处理后继续培养30min，再以0.75mM H₂O₂诱导6h，将细 胞破碎后以PBS洗3遍，加入20μM DCFH-DA在37℃下避光孵育处理30min。用流式细胞仪进 行细胞内活性氧的测定，激发光波长为498nm，检测波长为522nm。试验结果如图6所示。结 果表明，0.75mM H₂O₂诱导6h使细胞内活性氧水平增加到305.18％，而随着浓度的增加的灰毡 毛忍冬素G的预处理则可以明显降低H₂O₂诱导PC12细胞内的活性氧的产生，进一步说明灰毡 毛忍冬素G预处理对PC12细胞损伤起到了较好的预防作用。