基于阴离子交换柱高效分离出高活性水蛭素的生产工艺

摘要

本发明是基于一种新型阴离子交换柱（DEAE-硅胶分离柱），实现高效分离纯化水蛭素。以广西菲牛蛭制成的蚂蝗粉为原材料，属于中药制药领域，涉及动物有效成分的提取，目的是解决水蛭素提取复杂、成本高、难以工业化生产的问题。本发明的特征在于围绕这种新的价格低廉的DEAE-硅胶分离柱的分离纯化系统，设计了水蛭素分离纯化的新工艺。本工艺简单快速，成本低；并且所得到的水蛭素冻干粉活性高，回收率高，纯度高，保存期长，可为食品、保健食品、药品或化妆品等行业提供安全、优质的原料。

说明书

技术领域

本工艺属于生物医药的分离纯化，以及中药制成药精制等领域，具体涉及一种基于新型阴离子交换柱高效分离出高活性水蛭素的生产工艺。

背景技术

水蛭素(hirudin)是存在于吸血水蛭（蚂蝗）的唾液腺中的一种蛋白质，具有高度特异的抗凝血酶活性，抑制凝血酶结合底物，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。1984年，Haycraft发现水蛭提取物有抗凝血作用。1904年Jocoby首次从医用水蛭中分离得到这种活性组分，并命名为水蛭素。1955年，Markwardt成功的从医用水蛭头部分离纯化出纯品水蛭素，开始进行基础的生物化学和药理学研究，并于1970年确定水蛭素是凝血酶的特异性抑制剂。1986年，Harvey等得到水蛭素的cDNA，随后水蛭素基因在多种宿主中表达成功。天然水蛭素是由65个氨基酸组成的多肽，其作用有以下几个方面：1.具有抗凝血作用。不同来源和结构的水蛭素，其抗凝血机制不尽相同。2.抗凝血酶作用。水蛭素的抗凝血酶作用见于欧洲医用水蛭素（hiNmedic5nalix）L1j、亚洲水蛭素（菲牛蛭）、和印度水蛭等。水蛭素对凝血酶的作用分两步进行，首先使凝血酶带正电荷的非催化位点部分与水蛭素的带负电荷的极性C-端部分产生静电作用形成初始结合体，随后该结合体通过控制扩散迅速重排，形成同凝血酶活性位点紧密结合的复合物。在该复合物中，水蛙素的C-端结合在凝血酶的纤维蛋白原识别位点，抑制凝血酶对纤维蛋白原的激活作用，N-端则同凝血酶催化位点结合，抑制凝血酶的催化作用。3.抗血小板作用。1992年，Como等从墨西哥水蛭中提取出一种称为菲牛蛭抗血小板蛋白质，具有特异性抑制胶原又到血小板聚集的作用，而对其他诱导剂（如血、凝血酶等）诱导血小板聚集无抑制作用。4.降解纤维蛋白（原）作用。1984年，Malin-conlco等从亚马逊巨型水蛭中提取一种称为hementin的物质。这种物质可以降解纤维蛋白（原）的特定肋链，具有抗凝血酶活性并能显著抑制ADP诱导的血小板聚集，对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。

水蛭素还是一种非常稳定的蛋白质，在干燥状态下极其稳定，单纯的温度升高(100℃水浴)或pH值的改变 (l.47-12.9)都不影响其活力，在某些变性剂存在的情况下也非常稳定，只有当温度和PH值同时升高时其活力才开始下降。一般室温下水蛭素在水中能稳定存在6个月，80℃下加热15min不被破坏。提高溶液的pH值，其稳定性则降低。20℃下，在0.lmol/LHCI或 0.1mol/LNaOH中，可稳定15min，在pH=13的条件下经80℃处理15min即完全失活。

对现有技术中天然水蛭素的生产方法检索到的一些技术方案如下：

1.          中国专利：03113566.8发明名称：菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取技术。摘要：本发明提供了一种菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取方法，是通过引进优良种源或野外捕捉到健壮的菲牛蛭，进行人工分级分段驯、喂养，进行人工繁殖，待饲养到一定程度，采用化学物质刺激鲜活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液进一步分离过滤得到水蛭素粗品，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素，该菲牛蛭含抗凝血物质比其它品种菲牛蛭含量高，药用效果好，提取水蛭素方法简单，提取水蛭素后将菲牛蛭放回水池养殖，相隔一周或十天又可以再提取，每条鲜活菲牛蛭可以反复提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫克左右，产品质量好，又节约资源，提高了菲牛蛭的利用价值。

2.          中国专利：200610019531.0发明名称：一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用。摘要：本发明公开了以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用，该制备方法的特征在于包括吸血水蛭制浆、配制悬浊液和干燥三个步骤，所得到的粉末，它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。本发明具有工艺简单，生产成本低、产品保存期长、并可采用Matkwatdt凝血酶直接滴定法检测天然水蛭素含量，从而使质量稳定，产品疗效有保证等特点。水蛭素应用范围广泛，可通过常规的方法单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用，或与其他动、植物药制成复方制剂，用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。

3.          中国专利：200710026461.6发明名称：一种以菲牛蛭唾液为原材料的水蛭素生产工艺。摘要：一种以菲牛蛭唾液为原材料的水蛭素生产工艺，属于中药领域，涉及动物有效成分的提取。目的是解决传统谁找死提取工艺难以工业化生产的问题。该工艺用菲牛蛭唾液提取水蛭素，可以工业化生产。菲牛蛭唾液用生理盐水提取，提取液煮沸、过滤、取滤液。固形物用生理盐水提取，过滤、取滤液。合并前后的全部液体，加入Lyphgel处理两次，过滤、取滤液。滤液煮沸后迅速冷却，冷藏过夜。离心，去上清液减压浓缩后再冷冻干燥成冻干粉。本生产工艺简单，产品活力高，有很强的溶血栓左右。

4.          中国专利：200710026462.0发明名称：一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺。摘要：一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺，属于中药领域，涉及动物有效成分的提取。目的是解决传统谁找死提取工艺难以工业化生产的问题。该工艺采用从整体菲牛蛭中提取水蛭素，可以工业化生产。先把菲牛蛭匀浆，浆状物用生理盐水提取三次，过滤。滤液煮沸、过滤去除杂蛋白。收集滤液，经冷冻浓缩，醇沉后得水蛭素粗品。再用生理盐水洗涤水蛭素粗品，然后浓缩洗涤液，最后冷冻干燥得到产品。水蛭素生产工艺方法简单，成品质量合格。药理实验结果表明，用本工艺提取的水蛭素有很好的药理作用。

5.          中国专利：200710066096.1发明名称：一种天然水蛭素的有效成分的提取方法。摘要：本发明公开了一种天然水蛭素有效成分的提取方法，使用水清洗吸血水蛭干净后加入含量15~25%的乙醇溶液浸泡30-50小时后，过滤，得滤液和药渣；将菲牛蛭药渣绞碎，再加含量15~25%的丙酮水溶液浸泡，过滤，得滤液，分别将两次滤液真空回收乙醇和丙酮后，合并滤液，常规真空冷冻干燥，得到产品。本发明工艺简单，成本低廉，收率较高，产品质量好，保存期长，整个生产过程无“三废”排放，产品作为医药、美容、保健食品三大领域的原料。

6.          中国专利;201110237495.6发明名称：一种天然水蛭素的生产方法。摘要：本发明公开了一种天然水蛭素的生产方法，该生产方法的特征在于包括含天然水蛭素液体的提取、酸沉、加热、脱水和干燥等步骤，所得到的天然水蛭素粉末，可采用Warkawardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分的含量，使质量稳定，产品疗效有保证。该方法具有工艺简单、提取率高、生产成本低、产品纯度高、保存期长等特点，可为食品、保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料。

从上述检索到的文献资料了解到，目前国内研究提取水蛭素的方法，多是将水蛭绞碎或者干燥后用水、乙醇、超滤或层析法提取。但是，上述方法有很多不足之处，主要是提取以后有效成分不高，活性一般在150~6000ATU/g左右，而且根据不同提取物活性高低不等，杂质含量高，不适合注射用药，有的提取方法繁杂，有的方法过程较慢，不适合用于工业生产，所以目前水蛭素的提取方法还有很多人在研究，希望找到效率高、成本低、活性成分高的提取方法。

发明内容

本工艺是为了解决上述现有技术中存在的问题，提供一种基于新型阴离子交换柱高效分离出高活性水蛭素的生产工艺，这种工艺效率高、成本低，并且得到具有纯度高，活性高，质量好的天然水蛭素。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的基于新型阴离子交换柱高效分离出高活性水蛭素的生产工艺，包括下述步骤：

（1）从蚂蝗粉中粗提水蛭素：按照材料重量的2倍加入三氯乙酸提取液，8000r/min离心30min，上清备用；沉淀继续重复提取两次，所有上清液混合，调节上清液pH至4.0左右，加三倍冷丙酮沉淀，4℃静置过夜，回收上清中的丙酮，沉淀去丙酮备用；

（2）DEAE-硅胶柱分离纯化：向上述步骤(1)所得沉淀中加1-10倍量的超纯水，充分溶解，用DEAE-硅胶柱中压液相色谱进行分离纯化，并收集水蛭素峰位置洗脱液，备用；

（3）脱盐浓缩：把步骤(2)中所得上清液进行透析，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h；透析过的上清液通过旋转蒸发(40-70℃，0-250r/min)进行浓缩，0-8℃冷藏备用；

（4）于冻干机冻干，收集后密封保存。

所述步骤（2）中所述的DEAE-硅胶柱的填料为大孔硅胶，孔径在300-600 ?，其表面涂覆一层含二乙基胺基的聚合物，填料粒度为30-150μm。

所述的含二乙基胺基的聚合物为甲基丙烯酸二乙基氨基乙脂聚合物以及二乙基氨基乙基取代的纤维素。

所述步骤（2）中DEAE-硅胶柱分离纯化的流动相为纯盐溶液，无毒无污染，流动相流速高，分离效率好，柱温为常温，采用紫外检测器对样品溶液进行液相色谱检测。

步骤（3）中所述透析是使用的透析膜是截留分子量小于等于7000的透析袋，透析时间最少24h；浓缩是在40-70℃范围下旋转蒸发去除30%~80%的水分，得浓缩液。

根据水蛭素能与凝血酶特异性结合，使凝血酶失活，其结合比例是1:1的原理，用Matkwardt凝血酶直接滴定法可检测天然水蛭素的活性。

水蛭素的计量单位为国际单位，以ATU表示，凝血酶活性的国际单位为NIH，即1个ATU等于中和1个NIH凝血酶的水蛭素量。

天然蚂蝗粉中抗凝血活性最高的那一组分通常被认为是水蛭素。本工艺所得到的水蛭素粉末成品，可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其抗凝血活性。

天然水蛭素活性检测方法：

准确称取本品粉末0.01g，置于1.5ml离心管中，加入400μL 0.9%生理盐水溶液，摇匀使之溶解，配制成0.025g/ml供试品溶液。精密量取供试品溶液100μL，置1.5ml离心管中，加入含有0.5%人纤维蛋白原的三强甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（PH7.4） 200μL，摇匀，置水浴 (37±0.5)℃ 中，缓缓滴加每1ml（中）含40NIH（单位）的凝血酶溶液 ( 5 μL /min，边滴加边轻轻摇匀)至溶液中出现凝固为止，记录消耗凝血酶溶液的体积。按下式计算活性：

U = C1V1 / (C2V2 )

式中：U为每 1 g水蛭素的活性单位 (ATU/g)；

C1为凝血酶溶液的浓度 (NIH/mL) ；

C2为供试品溶液的质量浓度 (g/mL )； 

V1为消耗凝血酶溶液的体积 (μL) ；

V2为供试品溶液的加入量 (μL) ；

上述天然水蛭素活性检测方法均适用于天然水蛭素为主要原料所制成的各种产品的质量检测。

本发明的工艺简单、提取率高、生产成本低、产品纯度高、保存期长、可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其抗凝血活性，特别是本发明采用的与现有技术不同的提取、沉淀、分离纯化和干燥的工艺，从而使质量更稳定，携带和服用方便，可为食品、保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料，在临床应用中，根据不同的需要，可以将本发明制成具有针对性的产品。

经本发明的发明方法纯化所得的天然水蛭素纯度高，活性高，成本低，操作简单，易重复，可以进行工业化生产。

本工艺所得到的天然水蛭素产品可以用于食品、保健品、药品或化妆品的原料，具有抗凝溶栓、改善血液循环、促进新陈代谢等作用，在临床上用于防治心脑血管疾病，如中风、冠心病、高血脂等。

附图说明

图1为蚂蝗粉粗提液的HPLC图，可看出，蚂蝗粉中除水蛭素外，还含有大量的杂蛋白，致使提取高纯度水蛭素的难度比较大。经多次重复检测，并与广西南宁市金海科康医药科技有限公司提供的水蛭素纯化产物HPLC图（图3）对比分析得知 9号蛋白峰即水蛭素纯化产物峰。

图2为用DEAE-硅胶液相色谱柱分离纯化水蛭素提取液的色谱图，由图可以看出粗提液中仍然含有大量的杂蛋白，但是用所选DEAE-硅胶液相色谱柱可以把3号峰与其它蛋白很好地分离开。收集四个峰位置蛋白溶液，透析并冻干后采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测活性，发现3号峰蛋白抗凝血活性最大，平均在10000ATU/g左右，其余吸收峰位置蛋白的水蛭素活性都小于400ATU/g，所以3号蛋白峰即水蛭素纯化产物峰，这个部分的收集液也就是本实验的水蛭素纯化产物。

图3为广西南宁市金海科康医药科技有限公司提供的水蛭素纯化产物HPLC图，图中6号峰为水蛭素纯化产物峰。

图4为用本工艺得到的水蛭素纯化产物的HPLC图，图中2号峰为水蛭素纯化产物峰，可看出经过提纯的水蛭素纯度很高。与图3对比可以看出，经过本工艺提纯得到的水蛭素纯化产物比该公司提供的纯品纯度还要高。

HPLC条件：

色谱柱：TSK2000 7.8×300mm                检测器：UV 210nm

流动相：0.1M KH₂PO₄ 0.1M (NH₄)₂SO₄ PH=6.7    柱  温：20℃                            

进样量：10μL                              流  速：1mL/min。

DEAE-硅胶液相色谱住条件：

色谱柱：DEAE-硅胶液相色谱柱20×100mm     检测器：UV 210nm

流动相：A液：10mM Tris PH=7.0 B液：10mM Tris 1.0M NaCl PH=7.0

进样量：0.5mL                              流  速：5mL/min。

梯  度：  0% B 5min 0-50%B 30min            柱  温：20℃。

具体实施方式

实施例一： 

称取南宁市金海科康医药科技有限公司生产的蚂蝗粉粉末（活性为300ATU/g）20g，加入超纯水20ml， 5%TCA(PH 1.15) 20ml，8000r/min离心20min，上清备用；沉淀继续重复提取两次，所有上清液混合，调节pH至4.0，加三倍冷丙酮沉淀，静置过夜，HPLC检测结果见图1。

DEAE-硅胶柱液相色谱柱（20×100mm）分离纯化，色谱柱填充料为表面涂覆有一层甲基丙烯酸二乙氨基乙脂聚合物的大孔硅胶，大孔硅胶孔径300 ?，填料粒度为30μm。

采用紫外检测器对样品溶液进行液相色谱检测，检测波长210nm，流速5mL/min，梯度：0%B(A：10mM Tris-HCl PH=7.0，B：10mM Tris-HCl 1.0M NaCl PH=7.0)8min，0-50%B 30min，0%B 10min，收集水蛭素峰位置洗脱液，透析24h，中间换水5次，每次间隔大于2h。透析液旋转蒸发(47℃)掉50%的水分，冻干，收集，密封保存，检测结果见图2、图4。本方法所得到的水蛭素纯化产物经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品水蛭素纯化产物的活性为11600ATU/g，收率为1.12%。

实施例二：

称取南宁市金海科康医药科技有限公司生产的蚂蝗粉粉末（活性为160ATU/g）20g，加入超纯水20ml， 5%TCA(PH 1.15) 20ml，8000r/min离心15min，上清备用；沉淀继续重复提取两次，所有上清液混合，调节pH至4.0，加三倍冷丙酮沉淀，静置过夜，HPLC检测结果见图1。

DEAE-硅胶柱液相色谱柱（20×100mm）分离纯化，色谱柱填充料为表面涂覆有一层二乙基氨基乙基取代的纤维素的大孔硅胶，大孔硅胶孔径400 ?，填料粒度为60μm。

采用紫外检测器对样品溶液进行液相色谱检测，检测波长210nm，流速5mL/min，梯度：0%B(A：10mM Tris-HCl PH=7.0，B：10mM Tris-HCl 1.0M NaCl PH=7.0)5min，0-60%B 30min，0%B 10min，收集水蛭素纯化产物峰位置洗脱液，透析24h，中间换水5次，每次间隔大于2h。透析液旋转蒸发(47℃)掉60%的水分，冻干，收集，密封保存，检测结果见图2、图4。本方法所得到的水蛭素纯化产物经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品水蛭素的活性为6560ATU/g，收率为0.24%。

实施例三：

称取南宁市金海科康医药科技有限公司生产的蚂蝗粉粉末（活性为160ATU/g）20g，加入超纯水20ml， 5%TCA(PH 1.15) 20ml，8000r/min离心15min，上清备用；沉淀继续重复提取两次，所有上清液混合，调节pH至4.0，加三倍冷丙酮沉淀，静置过夜，HPLC检测结果见图1。

DEAE-硅胶柱液相色谱柱（20×100mm）分离纯化，色谱柱填充料为表面涂覆有一层甲基丙烯酸二乙氨基乙脂聚合物的大孔硅胶，大孔硅胶孔径500 ?，填料粒度为100μm。

采用紫外检测器对样品溶液进行液相色谱检测，检测波长210nm，流速5mL/min，梯度：0%B(A：10mM Tris-HCl PH=7.0，B：10mM Tris-HCl 1.0M NaCl PH=7.0)5min，0-60%B 30min，0%B 10min，收集水蛭素纯化产物峰位置洗脱液，透析24h，中间换水5次，每次间隔大于2h。透析液旋转蒸发(47℃)掉60%的水分，冻干，收集，密封保存，检测结果见图2、图4。本方法所得到的水蛭素纯化产物经采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测该产品水蛭素纯化产物的活性为6580ATU/g，收率为0.23%。