高效液相色谱-串联质谱测定卷烟主流烟气中咖啡酸含量的方法

摘要

本发明公开了一种高效液相色谱-串联质谱测定卷烟主流烟气中咖啡酸含量的方法，该方法包括如下步骤：用滤片捕集卷烟主流烟气中的咖啡酸，用甲醇萃取滤片，得到萃取液；用高效液相色谱/串联质谱仪测定得到的萃取液，外标法定量分析得出咖啡酸含量。本发明提供的是一种前处理简单、分离效果好、定性准确、样品分析时间短、检测灵敏度高的高效液相色谱-串联质谱测定卷烟主流烟气中咖啡酸含量的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及烟草和化学技术领域，特别是涉及一种高效液相色谱-串联 质谱测定卷烟主流烟气中咖啡酸含量的方法。

背景技术

咖啡酸是广泛存在于天然植物中并具有显著生物活性的化合物，具有较 广泛的抑菌作用，体外试验表明，有抗病毒活性，同时还有止血、解毒等作 用，因此，关于该化合物对人体健康的影响一直受到广泛关注。但是，在分 子水平上，该化合物在体外实验中可以导致DNA双链结构的断裂，在细胞 水平上，该化合物被发现还可能会导致染色体畸变和姐妹染色体互换，世 界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）将其归为2B类致癌物质。

蒲公英、忍冬藤、苍耳子等传统中药材中咖啡酸含量的测定方法的报道 较多，主要采用的是高效液相色谱法，紫外检测器进行定量分析，高效液相 色谱-串联质谱的检测方法也有少量报道。如杨雄志（广东药学院学报,2007, 23(2):144-145.）采用高效液相色谱法，用依利特BDS C18色谱柱进行分离， 甲醇/磷酸盐缓冲液为流动相，紫外检测器进行定量，建立了清咽宁喷雾剂 中咖啡酸含量的检测方法。刘燕等（华西药学杂志,2010,25(2):198-199.） 采用甲醇水溶液对蒲公英中的咖啡酸进行水浴回流提取，经C18色谱柱分离 后，紫外检测器进行定量，建立了蒲公英中咖啡酸含量的HPLC检测方法。 许高燕等（分析科学学报,2006,22(5):567-569.）将水溶性迷迭香提取物用 甲醇超声提取，提取液过滤膜后直接采用高效液相色谱-串联质谱测定其中 咖啡酸的含量，建立方法的检出限为5ng/mL。

咖啡酸也是烟叶多酚物质的一种，在烟叶中也有一定的含量分布。彭友 元等（分析实验室,2006,25(2):92-96.）将烟叶烘干，研成粉末，经乙醇水 溶液超声提取后采用毛细管电泳电化学检测法同时测定了含咖啡酸在内的 几种多元酚的含量。朱瑞芝等（分析实验室,2009,28(10):108-112.）也报道 了采用高效液相色谱-串联质谱测定烟叶中咖啡酸含量的方法。

关于卷烟主流烟气中酚类化合物的测定主要集中于邻-苯二酚、对-苯二 酚、苯酚、邻-甲酚、间-甲酚等几种高度关注的酚类化合物。如中国专利 200910066382.7公开了一种测定卷烟主流烟气中邻-苯二酚、对-苯二酚、苯 酚、邻-甲酚、间-甲酚等几种主要酚类化合物的方法，该测定方法是利用玻 璃纤维滤片捕集卷烟主流烟气中的主要酚类化合物，用乙酸水溶液萃取后过 滤，采用二维液相色谱分离系统串联荧光检测器进行检测，测定卷烟主流烟 气中这几种酚类化合物的含量。

卷烟在燃烧过程中，发生了蒸馏、干馏、热解、合成、冷凝等多种物理 和化学反应，形成大量新生化合物，咖啡酸在卷烟主流烟气中的含量采用何 种方法进行测定，相关文献报道较少，截至目前，尚未发现国内外有采用高 效液相色谱-串联质谱仪测定卷烟主流烟气中咖啡酸含量的任何专利和文献 报道。而且，烟气成分非常复杂，基质干扰严重，咖啡酸在烟气中的含量又 较低，已经建立的烟气中酚类化合物的检测方法能否适用于烟气中咖啡酸的 测定尚未可知。

2001年Hoffmann与其研究者对1991年的有害成分清单进行了修订和 补充，将咖啡酸列为卷烟烟气的69种有害成分之一，2002年Rodgman和 Green对烟气中已报道的有害成分进行了总结，也将咖啡酸列为149种卷烟 烟气有害成分之一。因此，建立一种能够快速、准确、分离效果好、灵敏度 高的卷烟主流烟气中咖啡酸含量的检测方法，是烟草行业当前的一项迫切任 务，对于研究和评价吸烟与健康问题也具有十分重要和迫切的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱-串联质谱测定卷 烟主流烟气中咖啡酸含量的方法，该方法是一种前处理简单、分离效果好、 定性准确、样品分析时间短、检测灵敏度高的高效液相色谱-串联质谱测定 卷烟主流烟气中咖啡酸含量的方法。

本发明采用的技术方案是提供一种高效液相色谱-串联质谱测定卷烟主 流烟气中咖啡酸含量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)用滤片捕集卷烟主流烟气中的咖啡酸，用甲醇萃取滤片，得到萃 取液；

(2)用高效液相色谱/串联质谱仪测定步骤(1)得到的萃取液；

(3)采用外标法定量分析得出咖啡酸含量。

优选地，步骤(1)所述的收集条件为将待测卷烟在GB/T16447-2004规定 的烟草及烟草制品调节和测试的大气环境条件下平衡48h。

优选地，步骤(1)所述滤片为剑桥滤片。

优选地，步骤(1)所述甲醇用量为40ml。

优选地，步骤(2)中用于测定的萃取液为0.5-1.0ml。

优选地，步骤(2)所述高效液相色谱仪条件是：C18反相柱，流动相A 为水，B为甲醇，梯度洗脱，柱温30℃，进样量1μL～10μL，流速0.2～ 0.4mL/min；所述质谱仪条件为：离子化模式为电喷雾，扫描模式为负离子， 雾化气25～35psi，气帘气10psi，辅助加热气20～30psi，碰撞气5psi，离 子源喷射电压5000～5800V，离子源温度350～450℃。

优选地，所述梯度洗脱的条件如下

时间/min 流速/mL﹒min^-1流动相A% 流动相B% 0 0.2 80 20 5 0.2 80 20 6 0.4 0 100 16 0.2 0 100

17 0.2 80 20 27 0.2 80 20

优选地，所述咖啡酸的检测参数为：定量离子对m/z为179.0/134.9， 定性离子对m/z为179.0/106.8，驻留时间为200ms，碰撞能为-22V。

优选地，步骤(3)所述定量分析采用外标法，配制0.05μg/mL～2μg/mL 的咖啡酸系列标准工作溶液，浓度梯度5个以上且均匀分布；将高效液相色 谱-串联质谱仪对标准溶液检测得到的咖啡酸峰面积作为纵坐标，咖啡酸浓 度作为横坐标，绘制标准曲线并得到回归方程，然后在相同条件下对样品进 行检测，将得到的咖啡酸峰面积代入方程中，即可计算得出咖啡酸的含量。

本发明的有益效果是首次提出了采用高效液相色谱-串联质谱测定卷烟 主流烟气中咖啡酸的方法；本发明的方法快速、准确、灵敏度高，样品的加 标回收率在95.62%～99.24%之间，样品重复性不大于5%，卷烟样品的定 性限可达0.02μg/mL，适用于各类卷烟主流烟气中咖啡酸的测定。

附图说明

图1是标准溶液的色谱图。

图2是实施例1卷烟样品1的卷烟主流烟气中咖啡酸的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作更详细的说明，但并不限制本发明。

本发明的仪器和试剂、材料

美国Applied Biosystems公司API3200型三重四级杆串联质谱仪，配有 电喷雾离子源以及Analyst系统软件，美国Agilent公司1200型高效液相色 谱仪，带自动进样器，德国Borgwaldt RM20H型吸烟机，电子天平（感量 0.1mg），回旋可调机械振荡器。

甲醇为色谱纯，去离子水；咖啡酸标准品，纯度≧98%。

试剂及溶液配制

标准储备液的配制：准确称取约25mg的氨基甲酸乙酯于25mL烧杯中， 精确至0.0001g，加入约10mL甲醇，完全溶解后转移至25mL容量瓶中， 用少量甲醇荡洗烧杯3～5次，洗涤液一并转移至容量瓶中，然后用甲醇定 容至刻度。

一级标准溶液的配制：用移液管准确移取5.0mL的标准储备溶液于 50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

系列标准工作溶液的配制：分别准确移取0.025mL、0.05mL、0.25mL、 0.5mL、1.0mL、15.00mL、30.00mL的一级标准溶液于50mL容量瓶中，用 甲醇定容至刻度，得到5个不同系列浓度的标准溶液，采用高效液相色谱- 串联质谱依次将此系列标准工作溶液进行测定，制作标准曲线。

图1为标准溶液的色谱图；图2为实施例1中卷烟样品1主流烟气中咖 啡酸的色谱图。

实施例1

高效液相色谱-串联质谱测定卷烟主流烟气中咖啡酸含量的方法，包括 以下步骤：

样品收集：将卷烟在（22±1）℃、相对湿度（60±3）%条件下平衡48 小时，然后按照烟草行业YC/T29-1996标准规定的条件进行卷烟抽吸，采 用玻璃纤维滤片捕集主流烟气，每组抽吸20支卷烟。

滤片萃取：将捕集有20支卷烟烟气粒相物的滤片放入150mL锥形瓶中， 加入40mL甲醇溶液，置于调速振荡器上振荡30分钟。

样品测定：移取约1.0mL萃取液于色谱瓶中，采用采用高效液相色谱/ 质谱仪进行测定，外标法计算卷烟主流烟气中咖啡酸的含量。

高效液相色谱仪条件为：

液相色谱柱：Waters X-Bridge C18 2.1×150mm，5μm；进样量：10μL； 流速：0.2～0.4mL/min；柱温：30℃；A为去离子水，流动相B为甲醇；

梯度洗脱程序如表1所示：

表1梯度洗脱程序

时间/min 流速/mL﹒min-1 流动相A% 流动相B% 0 0.2 80 20 5 0.2 80 20 6 0.4 0 100 16 0.2 0 100 17 0.2 80 20 27 0.2 80 20

串联质谱仪的条件参数为：

离子化模式：电喷雾（ESI）；扫描模式为负离子；雾化气25～35psi； 气帘气10psi；辅助加热气20～30psi；碰撞气5psi；离子源喷射电压5000～ 5800V；离子源温度350～450℃。述咖啡酸的定量离子对m/z为179.0/134.9， 定性离子对m/z为179.0/106.8，驻留时间为200ms，碰撞能为-22V。

利用高效液相色谱-串联质谱仪对系列标准溶液进行检测，将得到的咖 啡酸峰面积作为横坐标，咖啡酸浓度作为纵坐标，绘制标准曲线并得到回归 方程，回归方程为y=0.653x+0.00408（线性相关系数为0.9999），然后在相 同条件下对样品进行检测，将得到的咖啡酸的峰面积比值代入方程中，按照 下式计算得出咖啡酸的含量。

m=A×L/n

式中：

m—每支卷烟咖啡酸的含量，单位为微克/支（μg/cig）；

A—萃取样品中咖啡酸的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

L—萃取溶液体积，单位为毫升（mL）；

n—烟支数量，单位为支。

本发明方法的精密度和检测限

对某一标准样品连续进行6次测定，对咖啡酸的峰面积精密度进行考 察，结果如表2所示：

表2方法的精密度

进样次数 保留时间min 峰面积 1 1.98 9028.4 2 1.96 8985.7 3 1.97 9008.3 4 1.98 9014.9 5 1.96 9018.5 6 1.97 9034.7 平均值 1.97 9015.1 RSD 0.45% 0.19%

表中结果显示，无论是保留时间还是峰面积，相对标准偏差均小于5%， 表明可以精确测定卷烟主流烟气中咖啡酸的含量。

以最低浓度(0.05μg/mL)的标样重复进样10次，由测得的浓度值统计出 标准偏差，检测限（LOD）以3倍标准偏差求得，本方法的检测限为 0.02μg/mL，表明方法的灵敏度较高。

本发明方法的回收率

向某品牌卷烟滤片上分别添加100ng、200ng及300ng的咖啡酸标准物， 测得低、中、高加标三个水平下的咖啡酸含量值，每个水平平行测定三次， 平均值见表3。结果显示方法的回收率为95.62%～99.74%，表明方法具有 较高的回收率。

表3方法的加标回收率

咖啡酸添加量ng/cig 回收量ng/cig 平均回收率% 100 95.62 95.62 200 195.06 97.53 300 299.22 99.74

样品测定

采用本发明方法对两个卷烟样品主流烟气中的咖啡酸的含量进行了测 定，测定结果如下表4所示：

表4主流烟气中咖啡酸含量

卷烟样品 咖啡酸（ng/cig） 1 203.42 2 197.65

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，并非对本 发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的 基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式 予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍 处于本发明的保护范围之列。