日本囊对虾胸腺肽基因及其日本囊对虾胸腺肽的制备方法与应用

摘要

日本囊对虾胸腺肽基因及其日本囊对虾胸腺肽的制备方法与应用，涉及日本囊对虾胸腺肽基因的核苷酸序列以及其所编码的氨基酸序列。日本囊对虾胸腺肽基因包括日本囊对虾胸腺肽mjthm4基因、日本囊对虾胸腺肽mjthm3基因和日本囊对虾胸腺肽mjthm2基因。一个日本囊对虾总RNA的提取的步骤；一个日本囊对虾cDNA反转录的步骤；一个日本囊对虾胸腺肽基因的PCR扩增和序列分析的步骤；一个日本囊对虾胸腺肽的重组表达的步骤。所述日本囊对虾胸腺肽可用于制备抗对虾病毒药物。通过同源重组表达三种胸腺肽，可克服分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白在生物、食品、医药、农业等研究领域的广泛应用奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）胸腺肽基因的核苷酸序列以及其所 编码的氨基酸序列，尤其是涉及日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）胸腺肽蛋白及其制 备方法。

背景技术

胸腺肽是由胸腺上皮细胞分泌的一种淋巴细胞生长因子，研究发现，他们普遍存在于 多种组织细胞中。根据等电点(pI)的不同分为胸腺肽α、β、γ，其中等电点pI小于5.0的为 α胸腺肽，pI位于5.0～7.0的一组分子称为β胸腺肽，等电点pI大于7.0的为γ胸腺肽。至 今，已发现β胸腺肽有15种，除了在细胞内参与肌动蛋白的调控外，β胸腺肽还参与与其 它蛋白的相互作用及机体的抗感染保护等方面。目前，胸腺肽主要作为一种细胞免疫增强 剂，促进淋巴细胞成熟和增强机体免疫功能。研究表明，β胸腺肽参与了免疫调节、肿瘤发 病与转移、细胞凋亡、炎症反应、血管生成、凝血过程、创伤愈合、胚胎发育和神经发育 及再生等多种生理及病理过程。同时，其还参与了细胞表面及细胞核内受体信号的转导作 用。

对虾是水产养殖业的重要经济动物之一，日益严重的病害问题已严重制约了对虾养殖 业的健康发展。对虾属于无脊椎动物，缺乏特异性的免疫系统，但其却拥有众多的免疫因 子，以抵抗外界环境中病原的侵袭。因此，利用对虾本身的免疫抗病因子加强其对病害的 抵抗能力，将有助于对对虾病害的防治。

发明内容

本发明的第一个目的是提供日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因序列；

本发明的第二个目的是提供日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽蛋白序列；

本发明的第三个目的是提供日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽的制备方法。

本发明的第四个目的是提供日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽在制备抗对虾病 毒药物中的应用。

本发明所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因包括日本囊对虾 Marsupenaeus japonicus胸腺肽mjthm4基因、日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽 mjthm3基因和日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽mjthm2基因。

所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽mjthm4基因的分子类型为DNA，序列 特征：长度为501bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述日本囊对虾 Marsupenaeus japonicus胸腺肽mjthm4基因的序列如下所示，记为SEQ ID No.1：

1   ATGAGCGCCG AAACTCCCCT CAAGGACTTG CCCAAGGTTG ACCCCACCCT CAAGGGACAG 

61  CTCGAGGGAT TCTCCGCCGT AAACCTTAAG AAGATCGAGA CGGAGGAAAA GATCCACCTG 

121 CCAAACAAGG AGGACGTGGC ACAAGAGAAG CAACACATTG AACATCTACA GAACATCAGC 

181 GAGTTTCGCA GCGAAAGACT CAAACGAACG TCAACCTCTG AGAAGTTGGT CCTCCCCACT 

241 AGTCAAGACG TGGAAGCAGA GAAGAAAGCA CAGGCCCATC TGCAGGCTGT CGAAGGCTTC 

301 AATGCTGCAC AACTCAAGCA TGCCAATACC CAAGAAAAAA TTGTTTTACC TGCTAAGGAA 

361 GATATTGAGA ATGAGAAGGG TCAGCAGGCA CTCCGCCAGG GTATTGAGGG CTTTGACCAT 

421 ACCGCTCTGA AGAAGGCTCA GACGGCAGAG AAGAATACCC TTCCAACTAA GGAAATGATT 

481 GAGGAAGAGA AGAAGGCCTA A；

所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽mjthm3基因的分子类型为DNA，序列特 征：长度为387bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述日本囊对虾Marsupenaeus  japonicus胸腺肽mjthm3基因的序列如下所示，记为SEQ ID No.2：

1   ATGAGCGCCG AAACTCCCCT CAAGGACTTG CCCAAGGTTG ACCCCACCCT CAAGGGACAG 

61  CTCGAGGGAT TCTCCGCCGT AAACCTTAAG AAGATCGAGA CGGAGGAAAA GATCCACCTG 

121 CCAAACAAGG AGGACGTGGA AGCAGAGAAG AAAGCACAGG CCCATCTGCA GGCTGTCGAA 

181 GGCTTCAATG CTGCACAACT CAAGCATGCC AATACCCAAG AAAAAATTGT TTTACCTGCT 

241 AAGGAAGATA TTGAGAATGA GAAGGGTCAG CAGGCACTCC GCCAGGGTAT TGAGGGCTTT 

301 GACCATACCG CTCTGAAGAA GGCTCAGACG GCAGAGAAGA ATACCCTTCC AACTAAGGAA 

361 ATGATTGAGG AAGAGAAGAA GGCCTAA；

所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽mjthm2基因的分子类型为DNA，序列特 征：长度为273bp，类型为核酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述日本囊对虾Marsupenaeus  japonicus胸腺肽mjthm2基因的序列如下所示，记为SEQ ID No.3：

1   ATGAGCGCCG AAACTCCCCT CAAGGACTTG CCCAAGGTTG ACCCCACCCT CAAGGGACAG 

61  CTCGAGGGAT TCTCCGCCGT AAACCTTAAG AAGATCGAGA CGGAGGAAAA GATCCACCTG 

121 CCAAACAAGG AGGATATTGA GAATGAGAAG GGTCAGCAGG CACTCCGCCA GGGTATTGAG 

181 GGCTTTGACC ATACCGCTCT GAAGAAGGCT CAGACGGCAG AGAAGAATAC CCTTCCAACT 

241 AAGGAAATGA TTGAGGAAGA GAAGAAGGCC TAA。

本发明所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因的核苷酸序列可采用以下方 法获得：提取日本囊对虾Marsupenaeus japonicus的RNA，并将RNA反转录成cDNA，进 一步以cDNA为模板，经PCR扩增得到了SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的序 列。相关的核苷酸序列通过预测获得基因编码的多肽（SEQ ID No.4，SEQ ID No.5和SEQ ID  No.6），然后进行原核表达载体构建获得重组表达蛋白。

本发明所述的日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽为日本囊对虾Marsupenaeus  japonicus胸腺肽Mjthm4、日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm3和日本囊对虾 Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm2。

所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm4的分子类型为蛋白质，序列特 征：长度为166aa，类型为氨基酸，所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm4 的序列如下所示，记为SEQ ID No.4：

1   MSAETPLKDL PKVDPTLKGQ LEGFSAVNLK KIETEEKIHL PNKEDVAQEK QHIEHLQNIS 

61  EFRSERLKRT STSEKLVLPT SQDVEAEKKA QAHLQAVEGF NAAQLKHANT QEKIVLPAKE 

121 DIENEKGQQA LRQGIEGFDH TALKKAQTAE KNTLPTKEMI EEEKKA；

所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm3的分子类型为蛋白质，序列特 征：长度为128aa，类型为氨基酸，所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm3 的序列如下所示，记为SEQ ID No.5：

1   MSAETPLKDL PKVDPTLKGQ LEGFSAVNLK KIETEEKIHL PNKEDVEAEK KAQAHLQAVE 

61  GFNAAQLKHA NTQEKIVLPA KEDIENEKGQ QALRQGIEGF DHTALKKAQT AEKNTLPTKE 

121 MIEEEKKA；

所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm2的分子类型为蛋白质，序列特 征：长度为90aa，类型为氨基酸，所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm2 的序列如下所示，记为SEQ ID No.6：

1   MSAETPLKDL PKVDPTLKGQ LEGFSAVNLK KIETEEKIHL PNKEDIENEK GQQALRQGIE 

61  GFDHTALKKA QTAEKNTLPT KEMIEEEKKA。

这些蛋白具有SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示氨基酸序列的多肽；或 将SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取 代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的氨 基酸序列相似功能的多肽。

本发明所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽的制备方法，包括以下步骤：

一个日本囊对虾Marsupenaeus japonicus总RNA的提取的步骤；

一个日本囊对虾Marsupenaeus japonicus cDNA反转录的步骤；

一个日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因的PCR扩增和序列分析的步骤；

一个日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽的重组表达的步骤。

所述日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽可用于制备抗对虾病毒药物。

本发明通过提取日本囊对虾Marsupenaeus japonicus的总RNA，通过逆转录，通过引 物扩增和鉴定了3个胸腺肽基因mjthm4、mjthm3和mjthm2，通过pGEX-4T-2构建了重组 原核表达载体，在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白表达，为该蛋白的实际应用提供了基础。 通过同源重组表达三种胸腺肽，可以克服分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋 白在生物、食品、医药、农业等研究领域的广泛应用奠定基础。

本发明以日本囊对虾Marsupenaeus japonicus为研究材料，对正常虾与抗病虾的基因表 达差异进行比较研究，筛选获得了三种胸腺肽基因。研究发现病毒刺激早期它们转录表达 水平明显上调，平均达到3倍以上水平，其中两个在抗病虾中转录表达水平下调并达到显 著水平，说明日本囊对虾胸腺肽与对虾病毒的感染存在密切的联系，其可能具有重要的抗 病毒应用价值和药用价值。

附图说明

图1为日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因mjthm4在WSSV感染后其转录水平 的变化情况（磷酸缓冲液（PBS）为实验对照组，WSSV injection为WSSV感染组）。在图1 中，a为磷酸缓冲液（PBS）对照，b为WSSV感染。

图2为日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因mjthm3在WSSV感染后其转录水平 的变化情况（磷酸缓冲液（PBS）对照为实验对照组，WSSV感染为WSSV感染组）。在图2 中，a为磷酸缓冲液（PBS）对照，b为WSSV感染。

图3为日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因mjthm2在WSSV感染后其转录水平 的变化情况（磷酸缓冲液（PBS）对照为实验对照组，WSSV感染为WSSV感染组）。在图3 中，a为磷酸缓冲液（PBS）对照，b为WSSV感染。

图4为日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因mjthm3在普通对虾与抗WSSV 感染对虾中转录水平的情况（未感染WSSV虾为未感染WSSV的普通对虾组，抗WSSV感 染虾为未感染WSSV的抗WSSV感染对虾组）。在图4中，a为未感染WSSV虾，b为抗 WSSV感染虾。

图5为日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因mjthm2在普通对虾与抗WSSV 感染对虾中转录水平的情况（未感染WSSV虾为未感染WSSV的普通对虾组，抗WSSV感 染虾为未感染WSSV的抗WSSV感染对虾组）。在图5中，a为未感染WSSV虾，b为抗 WSSV感染虾。

图6为日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽Mjthm4和Mjthm3重组表达纯化的 SDS-PAGE图谱。1：重组载体pGEX-4T-2-Mjthm3在菌株BL21的未诱导表达；2：重组载 体pGEX-4T-2-Mjthm4在菌株BL21的未诱导表达；3：重组载体pGEX-4T-2-Mjthm3在菌株 BL21的诱导表达；4：重组载体pGEX-4T-2-Mjthm4在菌株BL21的诱导表达；5：经GST 介质纯化所得的目的蛋白Mjthm3；6：经GST介质纯化所得的目的蛋白Mjthm4；7：蛋白 分子量Marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件 如分子克隆实验室手册（1、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》， 科学出版社，2002年，第三版.）中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的 条件。

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施，其具体步骤是：

1．日本囊对虾Marsupenaeus japonicus总RNA的提取

取100mg日本囊对虾Marsupenaeus japonicus肝胰腺组织，加入液氮磨成粉末，加入1 mL TRIzol（Invitrogen公司）混匀后转入1.5mL离心管，室温静置5min裂解细胞；加入 0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置10min；4℃，12000g离心15min；将上层液体转 移至一新的无RNase离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀，室温放置8min；4℃，12000g 离心10min；弃去液体，加入1mL75%乙醇漂洗；4℃，7500g离心5min；弃去液体，沉 淀稍加干燥后溶于适量RNase-free的水中；用微量紫外分光光度计测量总RNA在OD₂₃₀、 OD₂₆₀和OD₂₈₀的吸光度，判定总RNA的浓度与纯度。

2．日本囊对虾Marsupenaeus japonicus cDNA反转录

在0.5mL离心管制备cDNA反转录反应液，包括2μg总RNA，1μL6mer随机引物 （200ng），1μL dNTP（10mM），用DEPC处理过的H₂O将总体积补至13μL；反应体系 65℃处理5min，立即放入冰浴中1min；稍离心，加入下列组分：4μL5×First-Strand Buffer， 1μL DTT（0.1M），1μL RNase Inhibitor（40U/μL）（TaKaRa公司）和1μL SuperScript^TM III reverse transcriptase（200U/μL）（Invitrogen公司）；反应体系轻弹混匀，稍离心；25℃5min， 50℃温育60min，70℃处理15min终止反应。

3．日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因的PCR扩增和序列分析

以日本囊对虾Marsupenaeus japonicus cDNA为模板，通过引物分别扩增得到胸腺肽基 因mjthm4、mjthm3和mjthm2的开放阅读框。

在25μL的反应体系中含1μL模板，1μL正反引物（20μM），2μL dNTP（各2.5mM）， 5μL5×PrimerSTAR^TM Buffer，0.5μL PrimerSTAR^TM HS DNA Polymerase（2.5U/μL）（TaKARa 公司），用H₂O将总体积补至25μL。PCR反应条件为：98℃10s、58℃30s、72℃35s（30 cycles）；4℃保存。PCR产物经纯化后与T载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞Top10 中，菌落PCR后选取有DNA片段的阳性克隆测序。

根据扩增获得的核苷酸序列推导出Mjthm4、Mjthm3和Mjrhm2的氨基酸序列，分别含 有166、128和90个氨基酸的多肽，其氨基酸序列详见SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ  ID No.6。

4．日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽对WSSV感染的应答

从WSSV发病养殖池中获得存活的日本囊对虾作为抗病虾，同时选取一批健康的日本 囊对虾进行WSSV注射感染。取抗病虾及WSSV感染不同时间点（0h、6h、12h、24h、 48h）的日本囊对虾肝胰腺液氮冻存，提取总RNA，去除基因组DNA，反转录为cDNA， 通过实时定量PCR确定WSSV感染后不同时相胸腺肽基因的转录表达量及抗病虾胸腺肽基 因的转录表达量，发现克隆的三个胸腺肽基因在WSSV感染早期明显上调（图1～3），推测 其与WSSV的感染相关；在抗病虾中胸腺肽基因mjthm3、mjthm2下调量几乎达到一半（图 4和5），该两个基因可能早期参与了对WSSV感染的防御或被WSSV感染所利用。该基因 和蛋白能够被作为抗病毒或药物应用。

5．日本囊对虾Marsupenaeus japonicus胸腺肽基因的表达

将含有mjthm4、mjthm3和mjthm2基因的质粒用带酶切位点的引物扩增，然后用相应 的限制性内切酶进行酶切，胶回收mjthm4、mjthm3和mjthm2基因片段，同时将质粒 pGEX-4T-2也用相同的酶进行酶切。将两者16℃连接6h。连接产物转化到大肠杆菌感受 态细胞DH5α中，提取质粒，测序验证。

将测序正确的质粒转化BL21，37℃生长15h后菌落PCR验证质粒转化的正确性，挑 选转化正确的菌落，接种到5mL含有100IU青霉素的LB培养基中，37℃摇培至A₆₀₀＝ 0.5时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1mM，16℃诱导12～16h，将菌 液收集至200mL的离心管中，5000g离心沉淀细菌细胞。将细菌细胞重新悬浮在30mL PBS 缓冲液A（140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄·12H₂O，1.8mM KH₂PO₄，pH=7.4） 中，超声波处理至菌液成半透明，再18000g离心20min，上清与预先用PBS缓冲液平衡的 GST介质Glutathione Sepharose4Fast Flow（GE公司）混匀，4℃结合4h，纯化过程按照纯 化试剂盒说明进行。纯化的蛋白经12%的SDS-PAGE电泳分析，其纯度达95％以上（参见 图6）。