一种鲁氏活性干酵母及生产方法,其制备的酱制品及方法

摘要

本发明涉及一种鲁氏活性干酵母，其中干酵母的细胞总数为300-500亿/克、活细胞率为50-85％、水分为4-6％、耐氯化钠浓度为≥16％。本发明还涉及一种鲁氏活性干酵母的制备方法，包含如下步骤：将鲁氏酵母菌种Saccharomyces rouxii接种到含糖量为5-20％的培养液中；将得到的种子培养液接种到含有营养源的种子发酵罐中通入无菌空气到含糖量为5-20％的培养液中进行培养，得到发酵罐种子培养液；将得到的发酵罐种子培养液接种到发酵罐中，后流加含糖量为15-30重量％的糖源、同时补充营养源，通入无菌空气在温度24-35℃条件下进行培养，得到流加培养液；分离；成型和干燥得到酵母颗粒。本发明还涉及使用上述鲁氏活性干酵母制备酱制品及其制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鲁氏活性干酵母，特别是涉及一种鲁氏活性干酵母的生产 方法。

背景技术

酱油是曲霉、酵母菌及细菌等微生物综合作用的产品，酱油酿造时利用这 些微生物产生的酶和代谢产物形成酱油的色香味的成分。酱油风味与酵母菌有 着密切的关系。耐盐性酵母能在较高食盐浓度下繁殖，在酱油发酵中产生乙醇 等醇类、醛类等香气及呈味的琥珀酸等；硝酸同化性的球拟酵母能生成微量的 4-乙基愈创木酚及对乙基苯酚等。酵母类除参与碳酰化合物、醛缩醇类、含硫 化合物等香气成份的生成外，还很大程度地参与存在于酱油中的氨基酸和有机 酸类的生成，酵母菌体自溶生成琥珀酸。由此可见，在酱醪中添加酵母菌来增 加酱油的香气成份是非常有效的途径。

酱醅中分离出的酵母菌有7个属，32个种，其中与酱油质量关系最密切的 是鲁氏酵母、易变球拟酵母、埃契氏球拟酵母、无名球拟酵母和酱醪接合酵母。 鲁氏酵母是最常见的耐高渗透压酵母，其特点是能生长在含糖量极高的物料 中，也能在含16％食盐的基质中繁殖。在制曲及酱醪发酵期间，由空气中自然 落入而繁殖的鲁氏酵母占酱醪中酵母总数的45％。在发酵温度过高的情况下， 由于酵母失去活性而影响酱油香气成分的形成，为了提高酱油的风味，有的工 厂在酱醪发酵后期，人工添加鲁氏酵母和球拟酵母，收到良好的效果。在高盐 稀态酱油发酵过程中，需添加两种酵母，即鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii 又称主发酵酵母)和T酵母(Torulopsis又称后熟酵母)。鲁氏酵母的添加技术 已经非常成熟，应用比较广泛，呈味效果已得到公认。

目前，一些较大型的酱油及酱类酿造工厂采用自培方式向酱醅中添加鲁氏 酵母菌，取得了一定的使用效果，但总体上存在菌种性能良莠不齐、操作繁琐、 费工费力、生产稳定性差等缺点。还有较多酱油及酱类酿造企业，由于市场上 没有专业应用于酱制品行业的商品酵母，而不能将酵母菌应用到生产中。

近年来国内外对鲁氏酵母有一些研究，但很少有将鲁氏酵母制作成活性干 酵母的大生产，主要问题是一些方法还处于实验室水平，重复性差，产率也很 低，并不适合大生产。

发明内容

本发明解决的技术问题是得到了一种鲁氏活性干酵母，特别是涉及一种生 产鲁氏活性干酵母的方法。

具体来说，本发明是通过下述技术方案解决技术问题的：

一种鲁氏活性干酵母，其特征在于，其中干酵母的细胞总数为300-500亿/ 克、活细胞率为50-85％、水分为4-6％、耐受氯化钠能力为≥16％。

本发明还提供了一种鲁氏活性干酵母的生产方法，其特征在于，用于培养 的酵母菌种为鲁氏酵母菌种Saccharomyces rouxii。

其中，一种所述鲁氏活性干酵母的生产方法，包含如下步骤：

(1)菌种培养：将鲁氏酵母菌种Saccharomyces rouxii接种到含糖量为 5-20％的培养液中，在温度24-35℃条件下进行培养得到种子培养液；优选含糖 量为10-20％，培养温度为30-35℃；

(2)发酵罐种子培养：将步骤(1)得到的种子培养液接种到含有营养源 的种子发酵罐中通入无菌空气到含糖量为5-20％的培养液中，在温度24-35℃条 件下进行培养，得到发酵罐种子培养液；优选通入无菌空气的风量控制在 10-30m³空气/m³发酵液/hr；优选培养液的含糖量为10-20％，培养温度为 30-35℃；

(3)发酵罐通气流加培养：将步骤(2)得到的发酵罐种子培养液接种到发 酵罐中，后流加含糖量为15-30重量％的糖源、同时补充营养源，通入无菌空 气在温度24-35℃条件下进行培养，得到流加培养液；优选通入的无菌空气风 量控制在30-80m³空气/m³发酵液/hr；

(4)分离：将步骤(3)得到的流加培养液进行分离得到鲜酵母；

(5)成型：在步骤(4)得到的鲜酵母中加入乳化剂进造粒得到成形的酵 母；以及

(6)干燥：将步骤(5)得到的成形酵母进行干燥得到酵母颗粒；

优选还包括对得到的酵母颗粒进行检测和/或包装工序；更优选检测参数 有细胞总数、活细胞率、水分和/或耐氯化钠浓度。

其中，步骤(1)中所述菌株培养经过斜面菌种培养、一级液体种子培养和 二级液体种子培养。

其中，步骤(1)，(2)和(3)中培养液的pH值为4-6，优选pH值为 5-6。

其中，步骤(3)发酵罐通气流加培养步骤重复进行两次以上。

其中，步骤(3)发酵罐通气流加培养步骤中，控制发酵液中乙醇的含量 在0.35％以下；优选通过降低糖源流加速度和加大通入无菌空气风量来控制发 酵液中乙醇的含量。

其中，所述营养源为氮源、磷源、氯化钾、硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、 VB6和生物素；优选氮源选自硫酸铵、碳酸氢铵、氨水、磷酸铵、磷酸氢铵和 磷酸氢二铵中的一种或其组合；优选磷源选自磷酸、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸 氢二铵中的一种或其组合；

其中，在步骤(3)发酵罐通气流加培养步骤中，营养源的加入方式为氮 源、磷源采用流加方式，氯化钾、硫酸镁及微量元素随同发酵罐种子培养液一 同加入；优选该步骤中加入氯化钾的质量为流加糖液总质量的0.1-1％。

其中，所述乳化剂选自山梨醇单硬脂酸酯、山梨聚糖月桂酸酯、山梨聚 糖棕桐酸酯、山梨聚糖硬脂酸酯、山梨聚糖硬脂酸甘油酯、山梨聚糖油酸酯或 山梨聚糖甘油三油酸酯中的一种或其组合。

本发明还提供了一种所述制备方法制备得到的鲁氏活性干酵母。

本发明还提供了一种酱制品，其使用上述的鲁氏活性干酵母制成的。

本发明还提供了一种应用所述鲁氏活性干酵母制备酱制品的方法。

其中，鲁氏活性干酵母的加入方法为在进行酱制品的最终发酵前加入复水 活化后的鲁氏活性干酵母进行最终发酵；优选加入鲁氏活性干酵母的质量为发 酵液干物质质量的0.5-1‰。

其中，鲁氏干酵母的加入时酱醪的温度为28-35℃，优选pH值为5.0-5.5。

其中，加入活化后的鲁氏干酵母中发酵过程中的发酵顶温不超过38℃。

本发明还提供了一种通过所述制备方法制成酱制品。

本发明的有益效果是：本发明制备鲁氏活性干酵母完全可以取代酱油及酱 类酿造工厂自培鲁氏酵母的全部工序，简化了酱油及酱类酿造工厂的生产工 艺，减少了因自培鲁氏酵母质量的不稳定导致整个生产不稳定的频率；使用本 发明的鲁氏活性干酵母酿造酱油，能提高酱油及酱类的乙醇含量50％-100％， 总酯含量提高50％-200％，显著提升了酱油及酱类的醇酯香味，改善了酱油品 质。

具体实施方式

本发明通过如下方法制备鲁氏活性干酵母，包括如下步骤：

(1)斜面菌种培养：将鲁氏酵母菌种接种到固体斜面上进行培养得到斜 面的酵母菌种；优选培养条件为在含糖量为5-20重量％，pH值为4-6的琼脂固 体斜面上，在24-35℃培养；更优选含糖量为10-20％，培养温度为30-35℃；

(2)种子培养：将步骤(1)得到的斜面酵母菌种接种到培养瓶中培养得 到一级液体种子培养液，后将该一级液体种子培养液接种到发酵罐中进行培养 得到二级液体种子培养液，后将该二级液体种子培养液接种到含有营养源(氮 源、磷源、氯化钾、硫酸镁及泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素)的种子发 酵罐中通入的无菌空气进行培养，得到发酵罐种子培养液；优选通入无菌空气 的风量控制在10-30m³空气/m³发酵液/hr；优选培养条件为在含糖量为5-20重 量％，pH值为4-6，24-35℃下培养；更优选含糖量为10-20％，培养温度为 30-35℃；

(3)发酵罐通气流加培养：将步骤(2)得到的发酵罐种子培养液接种到 发酵罐中，后流加含糖量为15-30重量％的糖、同时补充营养源，通入无菌空 气搅拌培养，在培养过程中，通过降低糖流加速度和加大通入无菌空气的风量 以降低发酵液中乙醇的含量，得到流加培养液；优选通入的无菌空气风量控制 在30-80m³空气/m³发酵液/hr；优选控制发酵液中乙醇含量在0.35％以下；更优 选氮源、磷源采用流加方式，氯化钾、硫酸镁及微量元素随同发酵罐种子培养 液一起加入；优选通入无菌空气搅拌培养的条件为pH值为4-6，在24-35℃培养 20-36小时；优选加入氯化钾的质量为流加糖液总质量的0.1-1％；其中氮源、 磷源、其他盐类以及微量元素和营养元素的添加按照常规培养酵母的比例进行 添加。

(4)分离：将步骤(3)得到的流加培养液进行分离得到鲜酵母；优选采 用叠片式分离机分离，更优选采用叠片式分离机分离后，用真空转鼓过滤；

(5)造粒：在步骤(4)得到的鲜酵母中加入乳化剂进行造粒；优选造粒 步骤是将加入乳化剂后的酵母乳放入造粒机中搅拌混匀，挤压成为直径为 0.5mm左右的长条状酵母条；挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须 面状；

(6)干燥：将步骤(5)得到的酵母条进行干燥；优选采用60-120℃沸腾 式干燥；

优选地还包含(7)检测：对得到的干燥的酵母颗粒进行质量检测；优选 检测参数有细胞总数、活细胞率、水分以及耐氯化钠浓度；

(8)包装：将步骤(7)检测后的干燥的酵母颗粒进行包装；优选采用铝 箔抽真空包装。

本发明制备的鲁氏活性干酵母在酱油及酱制备中的使用方法，一般为在制 备酱制品的工艺中，在最终发酵前加入进行复水活化后的本发明的鲁氏活性干 酵母后进行最终发酵制备得到所述的酱制品。

本发明的鲁氏活性干酵母可以用于在各种酱制品工艺中用于制备酱制品， 包括但不限于前固后稀工艺制备酱油的工艺，高盐稀态制备酱油工艺，酶法酿 造豆酱工艺。

具体来说，利用鲁氏活性干酵母制备酱制品的方法如下：

1.在前固后稀工艺制备酱油的工艺中，按照常规工艺依次将大豆浸渍、 蒸煮、冷却后加小麦粉、拌种曲、制曲、加稀盐水、下池进行固态低盐前 发酵(15天-20天)、加入浓盐水、加入复水活化后的鲁氏活性干酵母进行 浓盐稀态后发酵约1-2月、酱醪成熟、取出制备的酱油。

2.在高盐稀态制备酱油工艺中，按照常规工艺依次将大豆浸渍、蒸煮、 冷却后加小麦粉、拌种曲、制曲、加盐水、下池进行前发酵(15天-20天)， 加入浓盐水、加入复水活化后的鲁氏活性干酵母及球拟酵母进行浓盐稀态 后发酵约2-6个月后酱醪成熟、取出制备的酱油。

3.在酶法酿造豆酱工艺中，按照常规工艺依次将大豆蒸煮后与蒸熟的面 粉混合、加入酶制剂、加盐水、下池进行前发酵(14天左右)，加入复水 活化后的鲁氏活性干酵母及球拟酵母进行浓盐稀态后发酵约2-6个月、灭菌 取出制备的成品豆酱。

其中，在上述各方法中鲁氏活性干酵母在酱油及酱制备中的应用工艺 中鲁氏活性干酵母的处理和加入量按照如下参数：

(1)加入量：0.5-1‰(按干物质质量计)。

(2)复水活化：活性干酵母使用前必须用自来水或蔗糖水复水活化， 具体来说，自来水活化是用干酵母量的15-20倍33-35℃的温水，加入鲁氏活 性干酵母溶解活化30分钟，即可投入使用，活化时间控制在30分钟以内； 含蔗糖液活化是配2.5％的蔗糖溶液，用量为干酵母量的15-20倍，调温至 33-35℃，将鲁氏活性干酵母溶解于活化液中，在33-35℃下活化1-2小时左 右即可使用。

(3)添加时机：淋浇工段、酱醪温度降到28-35℃时添加或酱醪PH值 降到5.3左右酱醪温度降到28-35℃时添加。

(4)发酵顶温：发酵顶温不超过38℃。

(5)鲁氏酵母和球拟酵母添加顺序：鲁氏酵母和球拟酵母可以同时添 加，但有一定的拮抗效应；因此两酵母间隔10-15天添加即可。

通过上述方法制备的鲁氏干酵母完全可以取代酱油及酱类酿造工厂自培 鲁氏酵母的全部工序，简化了酱油及酱类酿造工厂的生产工艺，减少了因自培 鲁氏酵母质量的不稳定导致整个生产不稳定的频率。

本发明制备的鲁氏活性干酵母使用非常方便，只需对其进行简单的复水活 化后直接添加即可，完全可取代酱油及酱类酿造工厂自培鲁氏酵母的全部工序 且节省了工序；本发明通过对制备方法中各种参数的控制，使本发明的鲁氏活 性干酵母中细胞总数、活细胞率、水分、耐氯化钠浓度稳定在所述范围内，从 而得到了一种高活性干菌体。用本发明的鲁氏活性干酵母，避免了自培鲁氏酵 母细胞总数低，活细胞率低、杂菌感染而造成的生产不稳定，导致最终制备的 酱制品的质量不稳定。而通过本发明制备方法制备的鲁氏干酵母避免了上述自 培鲁氏酵母生产中质量的随机性，使鲁氏酵母的品质稳定下来，从而实现制备 酱油过程的质量的可预测性和稳定性，保障工厂的批量生产。

在制备过程中发明人通过加入较多量的氯化钾并且在开始直接加入到发 酵罐中，而不是通过流加的方式加入，其目的是在对鲁氏酵母进行发酵培养过 程中的盐的浓度的提高，使鲁氏酵母更加耐受高盐浓度，最终使制备的活性干 酵母的耐高盐能力较强，耐氯化钠的浓度大于质量百分比浓度16％。

在上述制备过程中的有关术语在此定义如下：

所述“糖源”是指在酵母发酵过程中，提供主要碳源的物质，包括但不限 于糖蜜如甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜，淀粉水解糖等。

所述“耐氯化钠浓度”是指在该氯化钠浓度时，酵母菌株能够保持正常的 繁殖代谢，是评价酵母菌株耐高盐能力的指标。

所述“酱制品”包括各种酱油和/或酱，例如豆酱、面酱、酱油等。

下面将通过具体的实施例来详细描述本发明的特征和各个方面。除非特别 指明，本发明中所用的实验方法和试剂均为本领域技术人员所公知的方法和试 剂。此外，实施方案应理解为说明性的，而不是要限制本发明的范围，本发明 的实质和范围仅由权利要求书限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发 明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、 分离加工条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例

首先，对下面实施例中鲁氏干酵母制备过程及产品进行分析时所用的测定 装置和测定方法进行说明如下：

鲁氏酵母菌种：商购的鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)菌种(购于上海 普林斯顿生物科技有限公司，来自于美国ATCC菌种库)

叠片式分离机：广重集团生产型号为D424

真空转鼓过滤机：西玛常州通用设备有限公司

造粒机：常州益民干燥设备有限公司

沸腾流化床：荆州市五环容器制造有限公司

球拟酵母菌种：商购的球拟酵母(Torulopsis)菌种(购于北京富众科技发 展有限公司仪器部，来自于美国ATCC菌种库)

麦芽汁固体培养基：生研(上海)生物科技有限公司

麦芽汁：英博金龙泉啤酒(湖北)有限公司

其中，具体测定方法如下：

耐氯化钠浓度的测定方法：

实验器材及培养基：

灭菌平皿、接种针、恒温生化培养箱、豆芽汁合成培养基(含有12.5％ 的豆芽汁)。

豆芽汁合成培养基的制备：取黄豆芽125克加水1升，煮沸0.5小时， 过滤，将滤液加水恢复到1升。分别加入12％、14％、16％、17％、18％、 19％、20％的氯化钠，制成豆芽汁氯化钠琼脂斜面.

检测方法

1.将本发明中待测酵母分别接种到上述豆芽汁合成培养基上。

2.在27℃倒置培养7天，观察待测酵母的生长情况。

3.检测结果：7天后对上述豆芽汁合成培养基上的酵母菌落进行观察， 能够生长的培养基即代表能耐受该培养基的盐浓度，不能生长代表不能耐 受该培养基的盐浓度。

发酵罐深层通气流加培养步骤中，乙醇的测定方法

实验器材：纱布、0.45μm过滤器、注射器、安捷伦高效气相色谱检测 仪(GC7890A)。

检测方法

(1)取发酵液将其进行八层纱布过滤得到过滤初液；

(2)将该过滤初液用0.45μm微孔过滤器过滤得到气相检测样品；

(3)将步骤(2)的处理样品进行气相色谱检测鉴定；

气相色谱检测条件：

进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；分流比：37∶1；载气：N₂； 色谱柱：反向HP-INNOWAX柱；

升温条件：起始温度40℃，保留5min，以4℃/min升温到73℃，再 以12℃/min升温到150℃，最后以25℃/min升温到180℃，终温保留2min。

干酵母中细胞总数的测定方法

将干酵母用无菌生理盐水活化后，用显微镜和血球计数板所测得总的细胞 数，是死细胞数和活细胞数之和；

干酵母中活细胞率的测定方法

将干酵母加入无菌生理盐水活化后，用次甲基蓝溶液进行染色，用显微镜 和血球计数板测得的酵母活细胞数和总细胞数之比的百分数，染上蓝色的细胞 为死细胞，没染上蓝色的细胞为活细胞；

干酵母中水分的测定方法为：以样品在103℃±2℃烘箱中烘干干燥，所失 质量的百分数即为水分值；

酱油中乙醇含量的测定方法

实验器材：纱布、0.45μm过滤器、注射器、安捷伦高效气相色谱检测 仪(GC7890A)等。

检测方法

(1)将酱油样品进行八层纱布过滤得到初液；

(2)将过滤初液用0.45μm微孔过滤器过滤得到气相检测样品；

(3)将处理样品进行气相色谱检测鉴定；

气相色谱检测条件：

进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；分流比：37∶1；载气：N₂； 色谱柱：反向HP-INNOWAX柱；

升温条件：起始温度40℃，保留5min，以4℃/min升温到73℃，再 以12℃/min升温到150℃，最后以25℃/min升温到180℃，终温保留2min。

酱油中总酯含量的测定方法

利用气相色谱-嗅闻-质谱联用技术(GC-O-MS)分析风味成分技术检测 酱油中酯类物质的含量。

酱油中总氮含量和氨基酸态氮的含量测定方法参考GB18186-2000中 的方法进行测定。

实施例1

1)斜面菌种培养：将鲁氏酵母菌种接种到含糖量为5重量％，pH值为4的麦 芽汁琼脂固体斜面上，在24℃培养24小时，得到斜面酵母菌种；

2)一级液体种子F瓶培养：将步骤1)的斜面酵母菌种接种1环到装有100ml 的含糖量为5重量％，pH值为4的麦芽汁F瓶中，在24℃培养24小时，得到一级 液体种子培养液约100ml；

3)二级液体种子卡氏罐培养：将步骤2)的一级液体种子培养液接种到装 有10L的含糖量为5重量％的麦芽汁，pH值为4的卡氏罐中，在24℃培养15小时， 得到二级液体种子培养液约10L；

4)发酵罐种子培养：将二级液体种子培养液接种到装有1m³的含糖量为5 重量％的淀粉水解糖，补充硫酸铵10千克、磷酸铵3.5千克、氯化钾5千克、 硫酸镁1.5千克、泛酸钙20克、VB115克、VB220克、VB620克、生物素25克， pH值为4的种子发酵罐中，在24℃通气搅拌培养培养15小时，通入的无菌空气 风量控制在10m³空气/发酵液m³/hr，最终得到发酵罐种子培养液约1m³；

5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到15m³发酵罐中，不断流加含糖量为15重量％pH值为4的淀粉水解糖，共流加11200 千克，同时补充硫酸铵150千克、磷酸铵35千克、氯化钾11.2千克、硫酸镁15 千克、泛酸钙400克、VB1 100克、VB2 150克、VB 680克、生物素200克，其 中硫酸铵、磷酸铵、采用流加方式，氯化钾、硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、 VB6、生物素随种子培养液一起加入，后在24℃通气搅拌培养20小时，通入的 无菌空气风量控制在30m³空气/发酵液m³/hr，发酵过程中每1小时检测一次发 酵液中的乙醇含量，当发酵液中乙醇含量超过0.35％时，通过降低糖的流加速 度和加大无菌空气的通风量以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％以下，最终得 到流加培养液约10.5m³；

6)分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤机过滤，得到鲜酵母 约2200kg；

7)造粒：在步骤6)的酵母乳中加入1kg的山梨醇单硬脂酸酯，在造粒机中 通过搅拌混匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状的 酵母条；

8)干燥：对步骤7)得到的酵母条采用沸腾流化床干燥；其中进风温度115 ℃，出风温度80℃，干燥时间25分钟；

9)检测：对步骤8)干燥后的酵母颗粒检测，测定质量技术指标细胞总数、 活细胞率、水分含量和耐氯化钠浓度结果见表1；

10)包装：对检测后的酵母颗粒采用铝箔抽真空的形式的包装成为鲁氏活 性干酵母产品。

实施例2

1)斜面菌种培养：将鲁氏酵母菌种接种到含糖量为20重量％，pH值为5的 麦芽汁琼脂固体斜面上，在35℃培养48小时，得到斜面酵母菌种；

2)一级液体种子F瓶培养：将步骤1)的斜面酵母菌种接种6环到装有250 的含糖量为20重量％，pH值为5的麦芽汁F瓶中，在35℃培养48小时，得到一 级液体种子培养液约250ml；

3)二级液体种子卡氏罐培养：将步骤2)的一级液体种子培养液接种到装 有20L的含糖量为20重量％的甘蔗糖蜜，pH值为5的卡氏罐中，在35℃培养48 小时，得到二级液体种子培养液；

4)发酵罐种子培养：将二级液体种子培养液接种到装有3m³的含糖量为20 重量％的甘蔗糖蜜，补充氨水150千克、磷酸氢二铵60千克、氯化钾20千克、 硫酸镁8千克、泛酸钙120克、VB1100克、VB2120克、VB6120克、生物素125 克，pH值为5的种子发酵罐中，在35℃通气搅拌培养培养48小时，通入的无菌 空气风量控制在30m³空气/发酵液m³/hr，最终得到发酵罐种子培养液约3m³；

5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到180m³发酵罐中，不断流加含糖量为30重量％pH值为5的甘蔗糖蜜，共流加85000千克， 同时补充氨水1100千克、磷酸氢二铵300千克，氯化钾600千克、硫酸镁120千 克、泛酸钙2400克、VB1360克、VB2750克、VB6360克、生物素1100克，其 中碳酸氢铵、氨水采用流加方式加入，氯化钾、硫酸镁及泛酸钙、VB1、VB2、 VB6、生物素随同种子培养液一起加入，后在35℃通气搅拌培养36小时，通入 的无菌空气风量控制在50m³空气/发酵液m³/hr，发酵过程中发酵过程中每1小 时检测一次发酵液中的乙醇含量，当发酵液中乙醇含量超过0.35％时，通过降 低糖的流加速度和加大无菌空气的通风量以使发酵液中乙醇含量控制在 0.35％以下，最终得到流加培养液75m³；

6)分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤机过滤，得到鲜酵母 31000kg；

7)造粒：在步骤6)的鲜酵母中加入240kg的山梨聚糖月桂酸酯，在造粒机 中通过搅拌混匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状 的酵母条；8)干燥：对步骤7)得到的酵母条采用沸腾流化床干燥；其中进风 温度105℃，出风温度75℃，干燥时间35分钟；

9)检测：对步骤8)干燥后的酵母颗粒检测，测定质量技术指标细胞总数、 活细胞率、水分含量和耐氯化钠浓度结果见表1；

10)包装：对检测后的酵母颗粒采用铝箔抽真空的形式的包装成为鲁氏活 性干酵母产品。

实施例3

1)斜面菌种培养：将鲁氏酵母菌种接种到含糖量为10重量％，pH值为6的 麦芽汁琼脂固体斜面上，在30℃培养36小时，得到斜面酵母菌种；

2)一级液体种子F瓶培养：将步骤1)的斜面酵母菌种接种4环到装有500ml 的含糖量为10重量％，pH值为6的麦芽汁F瓶中，在30℃培养36小时，得到一 级液体种子培养液约500ml；

3)二级液体种子卡氏罐培养：将步骤2)的一级液体种子培养液接种到装 有40L的含糖量为10重量％的麦芽汁和甜菜糖蜜的混合物，pH值为6的卡氏罐 中，在30℃培养30小时，得到二级液体种子培养液；

4)发酵罐种子培养：将二级液体种子培养液接种到装有5m³的含糖量为10 重量％的淀粉水解糖和甜菜糖蜜的混合物(1∶1)，补充氨水250千克、磷酸 氢铵90千克、氯化钾10千克、硫酸镁15千克、泛酸钙60克、VB140克、VB260 克、VB660克、生物素70克，pH值为6的种子发酵罐中，在30℃通气搅拌培养 培养30小时，通入的无菌空气风量控制在20m³空气/发酵液m³/hr，最终得到发 酵罐种子培养液约5m³；

5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到100m³发酵罐中，不断流加含糖量为25重量％pH值为6的淀粉水解糖和甜菜糖蜜的混 合物(1∶1)，共流加144000千克，同时补充氨水1700千克、磷酸氢铵350 千克、氯化钾1440千克、硫酸镁200千克、泛酸钙800克、VB1120克、VB2250 克、VB6120克、生物素350克，其中硫酸铵、碳氨水、磷酸氢二铵采用流加 方式，氯化钾、硫酸镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素随同种子培养液 一起加入，后在30℃通气搅拌培养30小时，通入的无菌空气风量控制在80m³空气/发酵液m³/hr，发酵过程中每小时检测一次发酵液中的乙醇含量，当发酵 液中乙醇含量超过0.35％时，通过降低糖的流加速度和加大无菌空气的通风量 以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％以下发酵过程中控制糖的流加速度为，最 终得到流加培养液约130m³；

6)分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤机过滤，得到鲜酵母 60000kg；

7)造粒：在步骤6)的酵母乳中加入130kg的山梨聚糖棕桐酸酯，在造粒机 中通过搅拌混匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状 的酵母条；

8)干燥：对步骤7)得到的酵母条采用沸腾流化床干燥；其中进风温度70 ℃，出风温度40℃，干燥时间65分钟；

9)检测：对步骤8)干燥后的酵母颗粒检测，测定质量技术指标细胞总数、 活细胞率、水分含量和耐氯化钠浓度结果见表1；

10)包装：对检测后的酵母颗粒采用铝箔抽真空的形式的包装成为鲁氏活 性干酵母产品。

实施例4

1)斜面菌种培养：将鲁氏酵母菌种接种到含糖量为15重量％，pH值为5.5 的麦芽汁琼脂固体斜面上，在30℃培养30小时，得到斜面酵母菌种；

2)一级液体种子F瓶培养：将步骤1)的斜面酵母菌种接种5环到装有400ml 的含糖量为15重量％，pH值为5.5的麦芽汁F瓶中，在30℃培养30小时，得到一 级液体种子培养液约400ml；

3)二级液体种子卡氏罐培养：将步骤2)的一级液体种子培养液接种到装 有25L的含糖量为15重量％的淀粉水解糖和甘蔗糖蜜的混合物，pH值为5.5的卡 氏罐中，在30℃培养20小时，得到二级液体种子培养液；

4)发酵罐种子培养：将二级液体种子培养液接种到装有4m³的含糖量为15 重量％的淀粉水解糖和甘蔗糖蜜的混合物(1∶2)，补充硫酸铵300千克、磷 酸100千克、氯化钾25千克、硫酸镁12千克、泛酸钙90克、VB160克、VB290 克、VB690克、生物素120克，pH值为5.5的种子发酵罐中，在30℃通气搅拌培 养20小时，通入的无菌空气风量控制在25m³空气/发酵液m³/hr，最终得到发酵 罐种子培养液约4m³；

5)发酵罐深层通气流加培养：将步骤4)的发酵罐种子培养液接种到150m³发酵罐中，不断流加含糖量为25重量％pH值为5.5的淀粉水解糖和甘蔗糖蜜的 混合物(1∶2)，共流加115900千克，补充硫酸铵1700千克、磷酸400千克、 氯化钾600千克、硫酸镁150千克、泛酸钙2300克、VB1370克、VB2800克、 VB6360克、生物素1200克，其中硫酸铵、磷酸采用流加方式，氯化钾、硫酸 镁、泛酸钙、VB1、VB2、VB6、生物素随同种子培养液一起加入，后在30℃ 通气搅拌培养28小时，通入的无菌空气风量控制在60m³空气/发酵液m³/hr，发 酵过程中减少糖的流加速度为以使发酵液中乙醇含量控制在0.35％，最终得到 流加培养液105m³；

6)分离：采用叠片式分离机分离，再用真空转鼓过滤机过滤，得到鲜酵母 42000kg；

7)造粒：在步骤6)的酵母乳中加入190kg的山梨聚糖硬脂酸酯，在造粒机 中通过搅拌混匀，挤压，挤入孔径约0.5mm左右的筛网，变为一条条龙须面状 的酵母条；

8)干燥：对步骤7)得到的酵母条采用沸腾流化床干燥；其中进风温度80 ℃，出风温度45℃，干燥时间50分钟；

9)检测：对步骤8)干燥后的酵母颗粒检测，测定质量技术指标细胞总 数、活细胞率、水分含量和耐氯化钠浓度结果见表1；

10)包装：对检测后的酵母颗粒采用铝箔抽真空的形式的包装成为鲁氏活 性干酵母产品。

表1实施例制备鲁氏活性干酵母的技术指标测定结果

  细胞总数(亿/克)   活细胞率(％)   水分(％)   耐氯化钠能力  实施例1   320   50   6.0   16％  实施例2   410   67   5.0   18％  实施例3   450   82   4.7   19％  实施例4   500   85   4.2   19％

上表表明，其中实施例1-4制备的鲁氏活性干酵母的细胞总数在300-500亿 /克，其中实施例2-4中的细胞总数为410-500亿/克；实施例1-4制备的鲁氏活性 干酵母的活细胞率均大于50％，其中实施例3和4中的活细胞率达到80％-85％； 实施例1-4制备的鲁氏活性干酵母的水分含量在4-6％之间，其中实施例3和4 中的水分含量在4-5％之间；实施例1-4制备的鲁氏活性干酵母的耐氯化钠浓 度均大于16％，其中在实施例2-4中耐氯化钠浓度达到18％-19％。上述结果证 明本发明的制备方法制备的鲁氏活性干酵母的质量较好。可以看出本发明制备 的鲁氏活性干酵母的各项参数均稳定在一定范围内，充分证明的本发明制备方 法制备得到的酵母的质量比较稳定，克服了自培酵母中活细胞数不稳定等缺 陷。

实施例5

将实施例1中步骤10)中的鲁氏活性干酵母产品进行复水活化，复水活 化的条件为：采用2.5％的蔗糖溶液，用量为干酵母量的15倍，调温至33℃， 将鲁氏活性干酵母溶解于上述活化液中，在33℃下活化1小时后得到活化的 鲁氏干酵母待用。

同时按照国家专业标准ZBX 66022-87的高盐稀态发酵酱油酿造工艺规程 的方法将大豆浸渍除杂、蒸煮、冷却后加小麦粉、拌种曲和制曲得到酱油 曲，将后加入盐水进行前发酵(15天)。后对前发酵后的酱油曲中进行制 醪，制醪时加入浓食盐水食盐溶液用量为原料量的2倍；制醪后的第三天 起进行抽油淋浇，淋浇工段中，将上述已经活化的鲁氏干酵母按照鲁氏活 性干酵母的质量为发酵液干物质质量的0.5‰在酱醪pH值为5.0，酱醪温度降 到28℃时添加到发酵罐中，加入活化的鲁氏活性干酵母后发酵顶温不超过 38℃，间隔10天后添加球拟酵母，进行发酵5个月后进行发酵后的处理，其 中发酵后的处理方法以及后续步骤按照国家专业标准ZBX 66022-87中的方 法进行，最终得到酱油产品，后对其品质进行测定结果见表2。

实施例6

将实施例2中步骤10)中的鲁氏活性干酵母产品分别进行复水活化，复 水活化的条件为：采用2.5％的蔗糖溶液，用量为干酵母量的18倍，调温至 34℃，将鲁氏活性干酵母溶解于上述活化液中，在34℃下活化1.5小时后得 到活化的鲁氏干酵母待用。

同时按照国家专业标准ZBX 66022-87的高盐稀态发酵酱油酿造工艺规程 的方法将大豆浸渍除杂、蒸煮、冷却后加小麦粉、拌种曲和制曲得到酱油 曲，将后加入盐水进行前发酵(18天)。后对前发酵后的酱油曲中进行制 醪，制醪时加入浓食盐水食盐溶液用量为原料量的2.2倍；制醪后的第三 天起进行抽油淋浇，淋浇工段中，将上述已经活化的鲁氏干酵母按照鲁氏 活性干酵母的质量为发酵液干物质质量的0.7‰在酱醪pH值为5.3，酱醪温度 降到30℃时添加到发酵罐中，加入活化的鲁氏活性干酵母后发酵顶温不超 过38℃，间隔12天后添加球拟酵母，进行发酵5个月后进行发酵后的处理， 其中发酵后的处理方法以及后续步骤按照国家专业标准ZBX 66022-87中的 方法进行，最终得到酱油产品，后对其品质进行测定结果见表2。

实施例7

将实施例3中步骤10)中的鲁氏活性干酵母产品分别进行复水活化，复 水活化的条件为：采用2.5％的蔗糖溶液，用量为干酵母量的20倍，调温至 35℃，将鲁氏活性干酵母溶解于上述活化液中，在35℃下活化1.5小时后得 到活化的鲁氏干酵母待用。

同时按照国家专业标准ZBX 66022-87的高盐稀态发酵酱油酿造工艺规程 的方法将大豆浸渍除杂、蒸煮、冷却后加小麦粉、拌种曲和制曲得到酱油 曲，将后加入盐水进行前发酵(20天)。后对前发酵后的酱油曲中进行制 醪，制醪时加入浓食盐水食盐溶液用量为原料量的2.5倍；制醪后的第三 天起进行抽油淋浇，淋浇工段中，将上述已经活化的鲁氏干酵母按照鲁氏 活性干酵母的质量为发酵液干物质质量的0.8‰在酱醪pH值为5.5，酱醪温度 降到35℃时添加到发酵罐中，加入活化的鲁氏活性干酵母后发酵顶温不超 过38℃，间隔15天后添加球拟酵母，进行发酵5个月后进行发酵后的处理， 其中发酵后的处理方法以及后续步骤按照国家专业标准ZBX 66022-87中的 方法进行，最终得到酱油产品，后对其品质进行测定结果见表2。

实施例8

将实施例4中步骤10)中的鲁氏活性干酵母产品分别进行复水活化，复 水活化的条件为：采用2.5％的蔗糖溶液，用量为干酵母量的20倍，调温至 35℃，将鲁氏活性干酵母溶解于上述活化液中，在35℃下活化1.5小时后得 到活化的鲁氏干酵母待用。

同时按照国家专业标准ZBX 66022-87的高盐稀态发酵酱油酿造工艺规程 的方法将大豆浸渍除杂、蒸煮、冷却后加小麦粉、拌种曲(添加种曲比例 0.2％)，进行制曲得到酱油曲，之后加入盐水进行前发酵(20天)。后对 前发酵后的酱油曲中进行制醪，制醪时加入浓食盐水食盐溶液用量为原料 量的2.5倍；制醪后的第三天起进行抽油淋浇，淋浇工段中，将上述已经 活化的鲁氏干酵母按照鲁氏活性干酵母的质量为发酵液干物质质量的1‰在 酱醪pH值为5.5，酱醪温度降到35℃时添加到发酵罐中，加入活化的鲁氏活 性干酵母后发酵顶温不超过38℃，间隔15天后添加球拟酵母，进行发酵5 个月后进行发酵后的处理，其中发酵后的处理方法以及后续步骤按照国家 专业标准ZBX 66022-87中的方法进行，最终得到酱油产品，后对其品质进行 测定结果见表2。

比较例1

按照上述实施例4步骤1)-3)相同的方法制备得到二级液体种子培养液准 备待用。

按照国家专业标准ZBX 66022-87的高盐稀态发酵酱油酿造工艺规程的方 法将大豆浸渍除杂、蒸煮、冷却后加小麦粉、拌种曲和制曲得到酱油曲， 将后加入盐水进行前发酵(20天)。后对前发酵后的酱油曲中进行制醪， 制醪时加入浓食盐水食盐溶液用量为原料量的2.5倍；制醪后的第三天起进 行抽油淋浇，淋浇工段中，将上述二级液体种子培养液按照每毫升酱醪含 100万个鲁氏酵母的比例在酱醪pH值为5.5，酱醪温度降到35℃时添加到发 酵罐中，后发酵顶温不超过38℃，间隔15天后添加球拟酵母，进行发酵5 个月后进行发酵后的处理，其中发酵后的处理方法以及后续步骤按照国家 专业标准ZBX 66022-87中的方法进行，最终得到对照酱油产品，后对其品质 进行测定。

表2酱油品质测定结果

上表表明，实施例5-8制备的酱油在品质上与对比例使用自培的酵母制备 的酱油的品质相当；其中实施例5-8制备的酱油中乙醇含量大于1.26g/ml，在实 施例7和8中的乙醇含量达到1.60-1.70g/ml，远远高于对比例酱油中的乙醇含 量。实施例5-8制备的酱油中总酯含量大于1.04g/ml，在实施例7和8中的总酯含 量达到1.25-1.40g/ml，远远高于对比例酱油中的总酯含量。实施例5-8制备的酱 油中总氮含量均大于1.60g/ml与对比例相当。实施例5-8制备的酱油中氨基酸态 氮的含量大于0.84g/ml，在实施例7和8中的乙醇含量达到0.87g/ml，达到国家 标准。关于感官评价上，实施例5-8制备的酱油均达到国家标准GB18186-2000 中的特级标准。上述结果充分证明用本发明鲁氏活性干酵母制备的酱制品的品 质较好，均达到国家标准中的特级标准。

综合实施例1-8的数据证明，本发明的方法制备的酵母品质较为稳定，即 表明培养过程和制备过程达到本发明中的参数就可以制备出满足国家标准的 优质酱油。