一种快速检测黄牛SIRT1基因SNP的RFLP方法

摘要

本发明公开了一种快速检测黄牛SIRT1基因启动子区SNP的RFLP方法，以黄牛血液全基因组DNA为模板，以引物对P（F、R）为引物，PCR扩增黄牛SIRT1基因启动子区，用限制性内切酶SmaI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛SIRT1启动子区单核苷酸多态性。由于SIRT1涉及到的肌肉分化、脂肪生成等重要功能与黄牛肉质性状密切相关，该SNP又能显著影响SIRT1基因的启动子活性，并且与黄牛多种重要经济性状相关，本发明提供的检测方法为SIRT1基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，可用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，以便于快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测沉默调节因 子1(SIRT1)基因单核苷酸多态性(SNP)的RFLP（限制性片段长度多 态性）方法，具体地说，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸 多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段 大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。

背景技术

单核苷酸多态性（SNP）就是指基因组DNA序列中由于单个核苷 酸（A/T/C/G）的替换而引起的多态性。SNP属于第三代分子标记， 具有密度高、双等位基因、易实现自动化检测等优点，由于SNP具有 其它标记无比拟的优点，所以它作为一种研究工具已经在生命科学的 各个领域得到广泛应用。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见 的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但 SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判，而直接测序技术成本又 较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点 后使用限制性内切酶进行酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能 准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性， 又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位 点无特殊性要求。

SIRT1是酵母染色质沉默因子SIR2（silent information regulator2） 的哺乳动物同源体，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+） 的组蛋白脱乙酰酶。SIRT1在成熟组织中广泛表达，在胚胎早期和生 殖细胞中含量尤其丰富，参与调节机体内许多生理功能，包括众多基 因转录、能量代谢以及细胞衰老过程的调节等，尤其在糖代谢、脂代 谢、调节胰岛素分泌中发挥着重要的作用。在脂肪组织中SIRT1负调 控白色脂肪细胞中的过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome  proliferators activated receptors，PPARγ)，促进脂肪动员。在成肌细胞 中，降低内源SIRT1导致肌细胞标志基因表达增加，促进肌细胞分化。 对于黄牛育种来讲，分析SIRT1基因在牛脂肪代谢及肌肉分化中的机 制，对于提高黄牛的育肥效率、提高肉品质具有重要的理论意义。

目前国内外未见关于牛SIRT1基因遗传变异的研究，由于SIRT1 基因功能涉及脂肪代谢及肌肉分化等重要生长性状，本发明提供的检 测方法为SIRT1基因的SNP与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了 基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资 源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛SIRT1基因 启动子区的单核苷酸多态性，分析其对SIRT1基因启动子活性的影 响，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子 育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

以黄牛血液全基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer(缓 冲环境)、Mg^2＋、dNTPs存在的情况下，利用引物F、R进行PCR扩 增，然后用限制性内切酶对其进行酶切，再通过3.0%琼脂糖凝胶电 泳检测即可鉴定SIRT1基因转录起始位点上游274位（-274位，即 SEQ ID NO.1第127位）的单核苷酸多态性。

所述的PCR扩增引物为：

上游引物F：5′-GTATAGTCCACGGGGTTACAG-3′，

下游引物R：5′-CCAAACTTGTCTTTCAGAGTC-3′。

所述的PCR扩增条件是:25μL反应体系包括1U Taq DNA聚合 酶(MBI,Fermentas)，10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25M MgCl₂1.5μL(MBI,Fermentas)，2.5mM dNTPs2.5μL，50ng黄牛血液基因 组DNA，10μM的上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL；

所述的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃ 退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min；

所述的限制性内切酶为SmaI，10μL SmaI酶切体系为：权利要 求2中的PCR产物5μL，10×T Buffer1.0μL，0.1%BSA1.0μL，SmaI (10U/μL)0.5μL，ddH₂02.5μL，酶切消化条件：30℃恒温水浴5～8h。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0%。

所述的SmaI酶切3.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，电泳条带表现为： CC基因型表现为273bp，CG基因型表现为273bp、235bp和38bp， GG基因型表现为235bp和38bp。

本发明根据SIRT1基因启动子的序列设计引物，分别以5种黄牛 品种的血液基因组DNA为模板，进行PCR扩增，测序后与NCBI公 布的序列进行比较，发现转录起始位点上游274位（-274位，即SEQ ID NO.1第127位）存在单核苷酸多态性。

针对上述SNP位点，本发明通过设计引物进行PCR扩增，利用 特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确地检 测其单核苷酸的多态性。

本发明对5个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分 析，对上述SNP位点与黄牛重要生长性状进行关联分析，结果表明 该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。

附图说明

图1为黄牛SIRT1基因-274SNP位点测序图，箭头所示为突变位 点，图1A为CC基因型，图1B为CG基因型，其中方框内 为突变碱基，图1C为GG基因型；

图2为PCR扩增产物SmaI酶切3.0%琼脂糖凝胶电泳检测图， 泳道1为CC基因型，表现为273bp；泳道2为CG基因型， 表现为273bp、235bp和38bp；泳道3为GG基因型，表 现为235bp和38bp；泳道4为Marker；

图3为-274SNP位点区域转录因子结合情况示意图；

图4为-274SNP对SIRT1基因启动子活性的影响。

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛SIRT21基因-274位的单核苷 酸多态性进行检测，下面对本发明做进一步的详细说明。

1.黄牛血液样本的采集

本发明以5个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集 样本见表1：

表1黄牛样本的采集

2.血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1）冷冻血样（主要为血细胞）室温解冻，转移500μL至1.5mL  Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离 心10min（4℃），弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀 呈淡黄色；

2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞 沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3）加蛋白酶K至3μL（20mg/mL）并混匀，55℃过夜至澄清， 尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心 管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清 液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10 min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6）加氯仿、异戊醇混合液（24：1）500μL，充分混匀20min， 4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇， 混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%冰冷乙 醇漂洗DNA沉淀2次；

9）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇 挥发干净；

10）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至 DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存；

11）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%， 加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12）5℃保温10h左右；

13）等体积苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）和氯仿分别抽提 一次；

14）12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管 中；

15）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀 DNA；

16）倒掉液体，70%乙醇洗涤后晾干，加60μL灭菌超纯水溶 解，4℃待检测。

3.设计黄牛SIRT1基因的PCR扩增引物

以NCBI公布的牛SIRT1序列(NC_007329)为参考，利用Primer 5.0设计引物扩增SIRT1基因启动子区273bp片段，引物序列如下：

上游引物F：5′-GTATAGTCCACGGGGTTACAG-3′，

下游引物R：5′-CCAAACTTGTCTTTCAGAGTC-3′。

4.以引物F、R进行PCR扩增SIRT1基因启动子区273bp片段

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各 种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组 分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再 分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬 时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

25μL反应体系包括1U Taq DNA聚合酶(MBI,Fermentas)， 10×Buffer2.5μL(MBI,Fermentas)，25M MgCl₂1.5μL(MBI, Fermentas)，2.5mM dNTPs2.5μL，50ng黄牛基因组DNA，10μM 上、下游引物各0.25μL；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

72℃延伸10min；

对5个黄牛品种1255个样本的基因组DNA分别用引物F、R进 行PCR扩增，获得1255个包含SIRT1基因启动子区273bp片段的 DNA序列。

5.用限制性内切酶SmaI酶切消化PCR扩增的SIRT1基因启动子区 273bp基因片段

1）酶切反应消化体系（10μL）：PCR产物5μL，10×T Buffer1.0 μL，0.1%BSA1.0μL，SmaI(10U/μL)0.5μL，ddH₂02.5μL。

2）酶切消化条件：30℃恒温培养箱中消化5～8h。

6.限制性内切酶消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1）制作3.0%的琼脂糖凝胶（已经加入核酸染料），点样后120 V电压电泳40min；

2）待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3）根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性。

黄牛SIRT1基因-274位（即SEQ ID NO.1第127位）的单核苷 酸多态性为（图2）：CC基因型表现为273bp，CG基因型表现为273 bp、235bp和38bp，GG基因型表现为235bp和38bp。

7.黄牛SIRT1基因-274SNP位点的频率统计分析

1）基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总 个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频 率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数 量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对 比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋N_Aa3＋N_Aa4 ＋……＋N_Aan）/2N，式中P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体 中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体 数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种SIRT1基因的-274SNP中，基因型频率及遗传学 参数如表3所示。

表3黄牛SIRT1基因-274SNP基因型频率及遗传学参数

χ²_0.05(df=2)=5.99.

a χ²(HWE),哈代温伯格平衡χ²值.

8.黄牛SIRT1基因-274SNP位点对所处区域转录因子结合的影响

生物信息学分析表明-274附近序列存在一个细胞周期元件 （CDE）结合位点（图3），而-274C>G突变正处于该结合位点的核 心区域，G等位基因存在会导致CDE结合位点消失（图3），表明 -274C>G突变可能影响SIRT1基因的启动子活性。

9.黄牛SIRT1基因-274SNP位点对SIRT1基因启动子活性的影响

荧光素酶活性分析表明，在3T3-L1细胞中含G等位基因的启动 子片段活性是含C等位基因的60%左右(P<0.05,图4)，说明该突变能 显著影响SIRT1基因的启动子活性。

10.黄牛SIRT1基因-274SNP位点基因效应的关联分析

表4SIRT1基因启动子区-274位SNP南阳牛生长性状的关联分析

注：*P<0.05;**P<0.01.

基因型数据：SmaI识别的基因型（CC、CG和GG）。

生产数据：南阳牛6月、12月和24月的体重、体高、体长、胸 围、坐骨端宽和日增重等数据。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值， 再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS19软件 分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了 固定模型：

Y_ijk=μ++A_i+G_j+e_ijk，

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i个月观测的固 定效应，G_j为第j个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijk为随机误差。

结果表明（见表4）：关联分析表明，南阳牛在6月龄、12月龄、 24月龄时，GG纯合基因型比C等位基因携带者（CG和CC基因型） 有更高的体重、体高、体长，胸围、坐骨端宽和平均日增重，尽管有 些数值并未达到统计学意义上的显著水平。说明-274位的GG基因型 可以作做为一个提高黄牛体重的候选分子遗传标记。