乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法

摘要

本发明公开了乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法，包括精子的遗传失活、受精卵冷休克处理、孵化步骤，通过调整紫外线的照射距离和照射时间，寻找出灭活乌苏里拟鲿精子的最佳时间；在受精后不同的时间起点进行不同时间长度的冷休克，确定具有最高存活率的处理时间，作为冷休克的合适时间长度，从而筛选出适合于乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育的最适条件。按照雄鱼性逆转→人工雌核发育→超雄鱼→全雄鱼的技术路线，本发明为培育乌苏里拟鲿超雄鱼和单性全雄鱼养殖提供技术基础，扩大养殖规模、大幅提高产量，使养殖户大幅增收，具有广阔的产业化养殖前景。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类遗传育种技术领域，具体涉及乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法。

背景技术

鱼类具有两性生殖、雌核发育、杂种生殖等多种方式繁衍后代，延续种群。雌核发育(gynogenesis)是指卵子必须经精子激发才能产生只具有母系遗传物质的个体的有性生殖方式。营天然雌核发育的鱼类共同的特点是：成熟卵子的染色体数不发生减半，仍与体细胞的染色体数相同。当两性亲缘种的精子进入卵子后，仅起激活作用，精核一般呈致密状态，不发生原核化，不与雌性原核融合，所产生的子代与母本相似，基因型与母本相同或不尽相同，最终形成单性的雌性群体。

自Opperman et al证明鱼类雌核发育可以人工诱导以来，人工雌核发育的研究就十分活跃，广泛应用于家系纯化、遗传改良、性别分化和生殖控制等研究领域，特别是在性别控制和快速建立纯系方面有独特的应用。已经报道的人工雌核发育获得存活后代的鱼类有30多种，包括鲟鱼、虹鳟、鲤、鲫、草鱼、鳜鱼、罗非鱼等。但不同的鱼类因生活习性差异、生殖条件不同，一种鱼的雌核发育技术不能直接应用于另一种鱼类。针对每一种鱼都需要开发相应的雌核发育人工诱导技术与条件。人工诱导雌核发育通过使精子染色体遗传失活，这种不具有遗传信息的精子入卵后，卵子开始发育；再对卵子染色体进行加倍即可发育成正常幼鱼。

乌苏里拟鲿属鲶形目(silurformes)鲿科(Bagridae)拟鲿属（Pseudobgrus)，它是鲿科鱼类中生长速度最快的种类,最大个体长度可达1m，雌雄异体、异型，雄性个体显著大于雌性个体，成鱼体重雄性几乎为雌性的2倍甚至更多。其脂肪含量高,肉质细嫩,肉味鲜美,具有很高的食用价值和经济价值。如果能够进行单性全雄鱼养殖，将极大地提高产量及经济效益。按照雄鱼性逆转→人工雌核发育→超雄鱼→全雄鱼的技术路线，人工诱导雌核发育将成为决定成败的重要一环。但国内外至今未见这种鱼的雌核发育报道。

发明内容

    本发明要解决的技术问题是提供乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法，快速建立纯系，实现乌苏里拟鲿全雄性单性育种，提高产量，给养殖户带来丰厚的回报。

本发明通过以下技术方案实现：乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法，步骤包括：

（1）精子的遗传失活：取乌苏里拟鲿性成熟雄鱼的精液，所述精液与精子保存液按体积比1：5进行稀释，纱绢过滤后以1.0～1.8mm厚度均匀铺设到于培养皿中，将培养皿置于暗箱中用波长2537A的紫外灯照射10～25min，照度为66μW/cm²，照射距离为 10～25cm，摇床转速为30～50R/min；

精子保存液：每500ml溶液中含NaCl 2.5～4.0g， KCl 1.0～1.6g， CaCl₂ 0.1～0.2g， MgSO₄.7H₂O 0.1～0.2g，NaHCO₃ 0.2～0.4g，防腐剂 0.1～0.3g；

（2）受精卵冷休克处理：取乌苏里拟鲿性成熟雌鱼的卵子与步骤（1）中遗传失活后的精子进行人工授精，卵子受精后5～10 min，转移到0～4℃的冷水中10～40min，使受精卵染色体二倍化；

（3）孵化：将冷休克处理后的受精卵置于常温下的孵化装置中孵化，保持水有一定的流动性，水中含氧量充足，培育鱼苗。

不同的鱼类因生活习性差异、生殖条件不同，一种鱼的雌核发育技术不能直接应用于另一种鱼类。针对每一种鱼都需要开发相应的雌核发育人工诱导技术与条件。本发明的主要技术创造之处在于：通过调整紫外线的照射距离和照射时间，寻找出灭活乌苏里拟鲿精子的最佳时间；在授精后不同的时间起点进行不同时间长度的冷休克，确定具有最高存活率的处理时间，作为冷休克的合适时间长度。从而筛选出适合于乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育的最适条件，为超雄鱼的培育奠定基础。

乌苏里拟鲿性成熟雄鱼的精液与精子保存液按体积比1：5进行稀释：使得精子在离体后可以保持较长的存活时间，在随后的处理中活性受到抑制又不会死亡；同时便于后续遗传物质灭活时精子处于一种好的流动性，防止照射不均匀。

精子的遗传失活采用紫外线照射，避免使用化学物质对精子产生毒害作用；精子在遗传物质灭活后仍具有刺激卵细胞发育的能力；照射设备简单易行。 

冷休克法处理：避免使用化学物质如秋水仙素等恢复倍性时对卵的伤害，同时减少了环境污染；冷休克法抑制了第二极体的排出，使遗传物质恢复二倍性，保证胚胎的正常发育；子代的遗传物质系卵细胞加倍而成，绝大部分位点的基因纯合，可快速建立纯系。

本发明进一步改进方案是，所述步骤（1）中暗箱内设有摇床，培养器皿置于摇床的冰面上，摇床转速为30～50R/min。摇床转动使精子受到的紫外线辐射均匀。

本发明更进一步改进方案是，所述步骤（2）中人工授精采用半干法人工授精。半干法人工授精是成熟的技术，易于掌握。

本发明更进一步改进方案是，所述步骤（2）中人工授精后，将受精卵均匀单层铺设于尼龙网上。乌苏里拟鲿是粘性卵，很容易粘附到尼龙网上，受精卵置于尼龙网上便于后续的冷休克操作。

本发明与现有技术相比，具有以下明显优点：

本发明建立了乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育技术，按照雄鱼性逆转→人工雌核发育→超雄鱼→全雄鱼的技术路线，超雄鱼的获得是全雄鱼养殖的前提，取用雄鱼精子和雄鱼性逆转雌鱼卵子，利用本发明乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育技术可获得超雄鱼，超雄鱼性成熟后与原系普通雌鱼进行杂交，后代即可为全雄性。乌苏里拟鲿雄性个体显著大于雌性个体，成鱼体重雄性几乎为雌性的2倍甚至更多，其脂肪含量高,肉质细嫩,肉味鲜美。目前成鱼主要出口日本、韩国，因量小价高国内市场少见，本发明为实现乌苏里拟鲿单性全雄鱼养殖提供技术基础，全雄鱼养殖扩大了养殖规模、大幅提高产量，不仅可以开拓国内市场，使之登上国人餐桌，还可使养殖户大幅增收，具有广阔的产业化养殖前景。

附图说明

图1为本发明实施例操作流程图。

具体实施方式

下面结合附图1进一步详述本发明乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法，具体按以下步骤实施：

1. 亲鱼催产：选择体质健壮，皮肤无破损、腹部饱满柔软的乌苏里拟鲿雄鱼和雌鱼，进行人工性成熟催产。

2. 杀雄鱼取精巢：将雄鱼解剖后取精巢，研钵内用剪刀剪碎，研磨匀浆，以精液比精子保存液按体积比1﹕5进行稀释，纱绢过滤后以1.0～1.8mm厚度均匀铺设到直径90mm培养皿中； 

精子保存液配制如下：每500ml溶液中含NaCl 2.5～4.0g， KCl 1.0～1.6g， CaCl₂ 0.1～0.2g， MgSO₄.7H₂O 0.1～0.2g，NaHCO₃ 0.2～0.4g，防腐剂 0.1～0.3g 。

3. 精子遗传物质灭活：利用紫外线对DNA的破坏作用使精子灭活。在暗箱中安装2盏18瓦波长2537?的紫外灯，照度为66μW/cm2。将培养皿置暗箱中的摇床的冰面上，摇床转速30～50R/min，照射距离 10～25cm，照射时间分别为10～25minn，以灭活后精子缓慢游动为灭活标准。

4. 挤取卵子：在精子灭活快结束时取性成熟度好的雌鱼，挤取卵子于盆中，以湿布覆盖防止干燥。

5. 人工授精：采用半干法人工授精，受精卵均匀单层铺设于准备好的尼龙网上。

6. 受精卵冷休克处理：将上述带有受精卵的尼龙网5～10 min后，置入0～4℃的冷水中，冷休克时间设定10～40min,抑制第二极体的排出使卵子染色体加倍恢复倍性，使受精卵染色体二倍化。

7. 孵化：尼龙网取出后置于常温下的孵化装置中孵化，保持水有一定的流动性，水中含氧量充足，培育鱼苗。

具体1-11实施例中乌苏里拟鲿人工诱导雌核发育方法的实验数据及受精率、孵化率、开口期成活率见表一：

表一