核苷类似物或其盐、寡核苷酸类似物、基因表达抑制剂和用于检测基因的核酸探针

摘要

一种由以下通式(1)至(10)中任一个表示的核苷类似物及其盐：其中R1、R2、和R3是相同或不同的基团，并且R1、R2和R3中的每一个选自氢原子、核酸合成中的官能团的保护基、磷酸基、核酸合成中由保护基保护的磷酸基和用于固相合成的活化磷酸基；并且Ar是芳香族烃基和多环芳香族烃基中的一种。

说明书

相关申请的交叉引用

本国际申请要求基于于2010年11月30日向日本专利局提交的日本 专利申请No.2010-267314和于2011年8月31日向日本专利局提交的日 本专利申请No.2011-190048的优先权，它们的整体内容通过引用并入本 文中。

技术领域

本发明涉及核苷类似物或其盐、寡核苷酸类似物、基因表达抑制剂和 用于检测基因的核酸探针。

背景技术

短双链RNA、微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)是含有与靶 标信使RNA(mRNA)互补的碱基序列的寡核苷酸。所述靶标mRNA包括 例如导致疾病的基因的碱基序列。RNA干扰被定义为体内基因抑制机制， 其中短双链RNA、miRNA和siRNA抑制体内靶标mRNA的基因的表达。

siRNA是一种包括互补碱基序列的双链RNA。siRNA以序列特异方 式与靶标mRNA结合。与靶标mRNA结合的siRNA被并入到RNA-诱导 的沉默复合物(RISC)中，使得所述靶标mRNA被切割。如果导致疾病的基 因的碱基序列是明确的，则能够设计和合成具有与导致疾病的基因互补的 序列的siRNA。因此，如上所述合成的siRNA可以切割导致疾病的基因， 并且抑制疾病相关蛋白的表达。

miRNA是一种含有部分错配碱基对的双链RNA。miRNA识别部分地 具有互补序列的靶标mRNA，并且与所述靶标mRNA结合。当miRNA与 靶标mRNA结合时，使所述靶标mRNA不稳定，由此抑制所述靶标mRNA 的翻译。作为结果，基因的表达被抑制。已经清楚的是，miRNA精确地 控制各种生物学功能如生物体的传代、形态发生和细胞生长。最近，积极 地研究利用RNA干扰(一种降解具有与双链RNA互补的碱基序列的 mRNA的现象)的药剂。特别地，报道了miRNA与各种疾病如癌症有关。

例如，let-7miRNA的表达量在肺癌患者来源癌组织中降低。已报道 了肺癌患者的预后可以通过测定let-7miRNA的表达量确定。此外，已报 道了let-7miRNA对肺癌具有增生抑制作用(参见专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本未审查专利申请公开第2005-192484号

发明内容

本发明解决的问题

然而，let-7miRNA是一种正常寡核苷酸。因此，let-7miRNA易于被 血液或细胞中存在的各种各样的核酸酶降解。因此，很难利用正常寡核苷 酸如let-7miRNA作为miRNA药物。相比于用正常寡核苷酸形成的 miRNA，为开发利用miRNA的药物需要具有增加的核酸酶抗性和改善的 基因表达抑制作用的miRNA。然而，就本发明的发明人所知而言，几乎 不存在关于以上的报道。

此外，miRNA在部分地含有错配碱基对的状态下与靶标mRNA组成。 因此，对于一个miRNA存在多个靶标mRNA。作为结果，人miRNA靶 向极大量的mRNA。因此，很难确定靶向的mRNA的碱基序列。由于靶 标mRNA的碱基序列的确定导致miRNA基因表达控制机制的阐明，所以 这样的确定是生命科学领域要研究的重要问题之一。

在这样的背景下，本发明意图解决上述问题。本发明的一个目的是提 供具有增加的核酸酶抗性和改善的基因表达抑制作用的核苷类似物或其 盐和寡核苷酸类似物，以及可以促进靶标mRNA的碱基序列的确定的核 苷类似物或其盐和寡核苷酸类似物。

解决问题的手段

本发明中采用的一种特征性结构将在以下进行描述。

根据本发明的核苷类似物或其盐的特征在于为通式(1)至(10)(其中 R₁、R₂和R₃是相同或不同的基团，并且R₁、R₂和R₃中的每一个选自以下 各项：氢原子，核酸合成中的官能团的保护基，和磷酸基(phosphate group)； 并且Ar是芳香族烃基和多环芳香族烃基(polyaromatic hydrocarbon group) 中的一种。)

[化学式1]

在以上通式(1)至(10)中，对应于核苷的糖部分的部分是开环的，并且 包括三键。而且，上述官能团包括羟基和氨基。上述保护基定义为被引入 以保护官能团如羟基和氨基免于发生副反应的有机分子。

通式(10)中的Ar是芳香族烃基或多环芳香族烃基，并且优选是萘基、 蒽基、菲基和芘基。

在上述式(1)至(10)中，R₁优选是氢原子和核酸合成中的官能团羟基的 保护基中的一种。R₂优选选自以下各项：氢原子，核酸合成中的官能团羟 基的保护基，和磷酸基。R₃优选是氢原子或核酸合成中的官能团氨基的保 护基。

核酸合成中的官能团羟基的保护基的具体实例可以包括脂肪族酰基 (例如，乙酰基)，芳香族酰基(例如，苯甲酰基)，烷氧基，被芳基取代的甲 基(例如，苄基，对甲氧基苄基，4，4’-二甲氧基三苯甲基，4-一甲氧基三苯甲 基)，被脂肪族取代的甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基)，和被芳香 族取代的甲硅烷基(例如，叔丁基二苯基甲硅烷基)。

核酸合成中的官能团氨基的保护基的具体实例可以包括脂肪族酰基， 芳香族酰基，烷氧基，被芳基取代的甲基，被脂肪族取代的甲硅烷基，和 被芳香族取代的甲硅烷基。除了这些，可以包括被脂肪族取代的磺酰基， 被芳香族取代的磺酰基(例如，对甲苯磺酰基)，羰基(例如，叔丁氧基羰基， 苄氧基羰基)，酰胺基(二甲基甲酰胺基，二甲基乙酰胺基)等。

磷酸基优选是核酸合成中由保护基保护的磷酸基，或用于固相合成的 活化磷酸基。

核酸合成中由保护基保护的磷酸基的具体实例可以包括2-氯苯基磷 酸基和4-氯苯基磷酸基。

用于固相合成的活化磷酸基的具体实例可以包括 -P(OC₂H₄CN)(N(CH(CH₃)₂)₂)和-P(OCH₃)(N(CH(CH₃)₂)₂)。

根据本发明的核苷类似物或其盐特征在于是以下通式(11)(其中R₁和 R₂是相同或不同的基团，并且选自以下各项：氢原子，核酸合成中的羟基 的保护基，和磷酸基；X₁是与光发生反应并且提供能够共价键合的活性物 种的光反应性基团；并且X₂是烷基或至少一个氢被卤素取代的烷基)。

X₁中的光反应性基团被定义为吸收光以产生高度反应性中间体碳烯 并且可以与靶标分子共价键合的基团。

X₂中的烷基的实例可以包括具有1至5个碳的烷基。卤素的实例可以 包括氟、氯、溴和碘。

[化学式2]

此外，在通式(11)中，对应于核苷的糖部分的部分是开环的，并且具 有三键。

在以上通式(11)中，R₁和R₂优选是类似于在通式(1)至(10)中描述的R₁和R₂的基团。

X₁优选是二氮丙啶基(diazirine group)。

X₂优选选自以下各项：三氟甲基，二氟甲基和一氟甲基。

而且，根据本发明的寡核苷酸类似物特征在于是含有一个或多个由式 (1a)至(10a)中任一个表示的结构作为组分的寡核苷酸类似物(其中Ar是芳 香族烃基和多环芳香族烃基中的一种)。

[化学式3]

而且，根据本发明的寡核苷酸类似物特征在于是含有一个或多个由式 (11a)表示的结构作为组分的寡核苷酸类似物(其中X₁是与光发生反应并且 提供能够共价键合的活性物种的光反应性基团；并且X₂是烷基或至少一 个氢被卤素取代的烷基)。

X₁中的光反应性基团被定义为吸收光以产生高度反应性中间体碳烯 并且可以与靶标分子共价键合的基团。

X₂中的烷基的实例可以包括具有1至5个碳的烷基。卤素的实例可以 包括氟、氯、溴和碘。

[化学式4]

在以上通式(11a)中，X₁优选是二氮丙啶基。

X₂优选选自以下各项：三氟甲基，二氟甲基和一氟甲基。

此外，在以上通式(1a)至(10a)和(11a)中，对应于核苷的糖部分的部分 是开环的，并且具有三键。形成糖部分开环核苷的寡核苷酸衍生物的实例 是二醇核酸(GNA)。GNA具有其中甘油单元通过磷酸二酯键重复的结构。 对于(S)-GNA，已知的是，(S)-GNA的双链由于邻位交叉效应(gauche effect) 而被稳定化。因此，在含有类似结构的式(1a)至(10a)和(11a)中的一个或多 个作为组分的寡核苷酸类似物中，预期双链的稳定性提高。此外，由于式 (1a)至(10a)和(11a)具有不饱和键，所以在形成双链的寡核苷酸之间形成叠 加相互作用，由此使所述结构稳定。因此，当形成双链时的熵损失减少。 作为结果，预期该双链被热力学稳定化。

根据本发明的″其盐″被定义为根据本发明的核苷类似物和寡核苷酸类 似物的盐，因为这些类似物可以转化为盐。尽管对盐没有特别限制，但是 盐的实例可以适当地包括碱金属盐如钠盐、钾盐和锂盐，碱土金属盐如钙 盐和镁盐，金属盐如铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐和钴盐，无机盐如铵 盐，作为有机盐的胺盐如叔辛基胺盐(t-octylamine salt)、二苄基胺盐、吗 啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、胍 盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、N，N’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁 卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、N-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基 铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐，氢卤酸盐如氢氟酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸 盐和氢碘酸盐，无机酸盐如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐，低级烷 基磺酸盐如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐，芳基磺酸盐如苯磺酸盐 和对甲苯磺酸盐，有机酸盐如乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、 柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐，以及氨基酸盐如甘氨酸盐、赖 氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。

根据本发明的寡核苷酸类似物可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。 单链寡核苷酸可以与含有至少部分与一条链互补的序列的寡核苷酸结合 以形成双链。寡核苷酸被定义为通过聚合几个至100个核苷酸形成的聚合 物。

根据本发明的基因表达抑制剂的特征在于含有根据本发明的寡核苷 酸类似物。

基因表达抑制剂被定义为刺激DNA或mRNA以抑制复制、转录和翻 译DNA或mRNA的过程的分子。

根据本发明的用于检测基因的核酸探针的特征在于包含这样的寡核 苷酸类似物，该寡核苷酸类似物含有一个或多个由上述通式(11a)中任一个 表示的结构作为组分。

在以上通式(11a)中，X₁优选是二氮丙啶基。

X₂优选选自以下各项：三氟甲基，二氟甲基和一氟甲基。

用于检测基因的核酸探针被定义为用于可视化和检测DNA或mRNA 的短链DNA或RNA分子。

这样的用于检测基因的核酸探针的实例包括这样的DNA微阵列，该 DNA微阵列包含含有一个或多个由式(11a)表示的结构作为组分的寡核苷 酸类似物。

发明效果

根据含有一个或多个根据本发明的核苷类似物的结构(式(1)至(11))作 为组分的寡核苷酸类似物，对应于正常核苷的糖部分和碱基部分的部分被 化学修饰，使得该寡核苷酸类似物难以被核酸酶识别。作为结果，认为相 比于正常寡核苷酸，核酸酶抗性增加。此外，通过miRNA的热力学稳定 性发生改变的事实，认为相比于正常寡核苷酸，基因表达抑制作用可以增 加。

依照根据本发明的基因表达抑制剂，含有一个或多个根据本发明的核 苷类似物的结构(式(1)至(11))作为组分的寡核苷酸类似物作为miRNA起 作用。该miRNA识别并与具有部分互补序列的靶标mRNA结合，使得该 靶标mRNA不稳定，由此抑制该靶标mRNA的翻译。作为结果，可以抑 制基因表达。

此外，含有一个或多个由式(11)表示的寡核苷类似物的结构作为组分 的寡核苷酸类似物作为用于检测基因的核酸探针起作用。当该用于检测基 因的核酸探针被光照射时，形成能够共价键合的活性物种。因此，该用于 检测基因的核酸探针与靶标mRNA交联，由此使得能够捕获靶标mRNA。 作为结果，所捕获的mRNA的碱基序列可以通过利用所述用于检测基因 的核酸探针确定。

附图说明

图1是显示Tm测量结果的图。

图2是显示Tm测量结果的图。

图3是显示Tm测量结果的图。

在图4A和4B中，图4A是显示考察当使用psi199a3p载体时的基因 表达抑制能力的结果的图；并且图4B是显示考察当使用psi199a5p载体时 的基因表达抑制能力的结果的图。

在图5A和5B中，图5A是在用于考察正常RNA的核酸酶抗性的电 泳之后的凝胶照片；并且图5B是在用于考察具有被核苷类似物(1)取代的 3’末端的RNA的核酸酶抗性的电泳之后的凝胶照片。

图6是显示考察正常RNA的核酸酶抗性和具有被核苷类似物(1)取代 的3’末端的RNA的核酸酶抗性的结果的图。

图7是在显示交叉偶联结果的电泳之后的凝胶照片。

图8是根据本发明的用于检测基因的核酸探针的示意图。

图9是显示Tm测量结果的图。

图10是显示考察含有核苷类似物(1)作为组分的siRNA的基因抑制能 力的结果的图。

图11是显示考察含有核苷类似物(10)作为组分的siRNA的基因表达 抑制能力的结果的图。

具体实施方式

以下将描述本发明的实施方案。

由于在本文中将使用缩写，所以在以下首先示出在本文中使用的缩写 列表。

[缩写列表]

BF₃EOEt：三氟化硼乙醚络合物

THF：四氢呋喃

EtOAc：乙酸乙酯

TBDMSCl：叔丁基二甲基氯硅烷

Pd(PPh₃)：四(三苯基膦)钯

TEA：三乙胺

TBAF：四-正丁基氟化铵

PdCl₂(PPh₃)₂：双(三苯基膦)氯化钯(II)

TsCl：对甲苯磺酰氯

DMAP：N，N-二甲基-4-氨基吡啶

DMTrCl：二甲氧基三苯基甲基氯

DIPEA：N，N-二异丙基乙基胺

亚磷酰胺试剂(Amidite reagent)，i-Pr₂NP(Cl)OCE：

2-氰基乙基二异丙基氯-亚磷酰胺

DMF-DMA：N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛

CPG：可控多孔玻璃

WSC：水溶性碳二亚胺

X-phos：2-二环己基膦基-2’，4’，6’，-三异丙基联苯

NaHCO₃aq.：碳酸氢钠水溶液

NaCl aq.：氯化钠水溶液

NMR：核磁共振

CDCl₃：氘代氯仿

Tm：解链温度

[核苷类似物和合成核苷类似物的方法的概要]

接下来，将描述核苷类似物和合成核苷类似物的方法的概要。

根据本发明的核苷类似物的糖部分通过使用提供有环氧基的伯醇作 为原料进行合成。更具体地，首先，在通过甲硅烷基化合物保护提供有环 氧基的伯醇的羟基之后，在环氧基开环时引入具有被甲硅烷基保护的末端 的乙炔基团。接着，通过环氧基开环形成的羟基通过甲硅烷基保护。之 后，将乙炔侧链的末端甲硅烷基选择性地除去，由此获得能够与以下描述 的根据本发明的核苷类似物的碱基部分发生偶联反应的糖部分前体。

在另一方面，根据本发明的核苷类似物的糖部分选自以下各项：其中 杂环的一个氢原子被卤素原子取代的卤素取代产物；其中芳香族烃的一个 氢原子被卤素原子取代的卤素取代产物；和其中多环芳香族烃的一个氢原 子被卤素原子取代的卤素取代产物。其中芳香族烃的一个氢原子被卤素原 子取代的卤素取代产物包括这样的其中芳香族烃的一个氢原子被卤素原 子取代的卤素取代产物，所述芳香族烃具有与光发生反应并且提供能够共 价键合的活性物种的光反应性基团以及烷基或至少一个氢原子被卤素取 代的烷基。

上述糖部分前体和碱基部分在钯催化剂存在下经过偶联反应而获得 偶合体。之后，甲硅烷基被去保护，然后进行萃取、洗涤和纯化过程。因 此，可以获得所需的核苷类似物。

接下来，将参照实施例描述本发明的实施方案。然而，本发明不受限 于这些实施例。要注意的是，在以下描述的实施例中，为了促进理解作为 实例例举的核苷类似物和前面说明的通式之间的关系，利用对通式给出的 编号(n)，将作为由通式(n)表示的核苷类似物的实例描述的核苷类似物指定 为核苷类似物(n)(n为1至11的整数)。然而，这种指定不意味着由通式(n) 表示的核苷类似物局限于在以下实施例中例举的核苷类似物(n)。

实施例

<1.核苷类似物(1)的合成：(S)-5-(4，5-二羟基戊-1-炔基)-1-甲基嘧啶 -2，4(1H，3H)-二酮)>

核苷类似物(1)借助于以下[化学式5]中所示的合成方法1进行合成。

[化学式5]

<1.1.合成方法1中的合成路线(a)>

将咪唑(6.6g，97.2mmol)和DMF(75ml)加入到(R)-缩水甘油(2.7ml， 40.5mmol)(13a)中，并搅拌所得混合物。然后，加入TBDPSCl(12.6ml，48.6 mmol)并在0℃反应过夜。第二天，在通过薄层色谱(TLC)(下文称为TLC) 观察到原料的样点(spot)消失之后，用乙酸乙酯和蒸馏水萃取产物，以回收 有机层。该有机层用饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤，并用无水硫酸钠干 燥。使用真空蒸发器蒸发溶剂，并分离剩余物并且通过硅胶柱色谱法(己烷∶ 乙酸乙酯＝50∶1)纯化。由此，获得化合物(13b)(S)-叔丁基(环氧乙烷-2-基甲 氧基)二苯基硅烷(4.5664g，15mmol，37％)，为无色透明液体。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.67-7.65(4H，m)，7.41-7.35(6H，m)， 3.83(1H，dd，J＝12.0Hz，3.2Hz)，3.69(1H，dd，J＝12.0Hz，4.8Hz)，3.13-3.09(1H， m)，2.73(1H，dd，J＝9.2Hz，4.0Hz)，2.59(1H，dd，J＝5.2Hz，2.8Hz)，1.0(9H，s). ¹³C NMR(CDCl₃)δ：135.5，129.7，127.7，64.3，52.2，44.4，26.7，19.2.

<1.2.合成方法1中的合成路线(b)>

在氩气氛下将化合物(13b)(2.5268g，8.0mmol)加入到50ml梨形烧瓶 中，并溶解在THF(10ml)中，以获得溶液(A)。在氩气氛下，将TMS-乙 炔(1.656ml，12.0mmol)，THF(10ml)，n-BuLi(7.2288ml，12.0mmol)和 BF₃·OEt₂(1.5968ml，13.0mmol)以此顺序加入到50ml回收烧瓶(recovery  flask)中，并且最后将溶液(A)加入到混合物中。所获得的产物在-78℃反应 过夜。第二天，在观察到原料的样点消失之后，加入作为缓冲液的NH₄Cl (20ml)以终止反应。反应产物用乙酸乙酯和蒸馏水萃取，以回收有机层。 该有机层用饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥。利用 真空蒸发器使所得产物减压并浓缩，并将剩余物分离并且通过硅胶柱色谱 (己烷∶乙酸乙酯＝20∶1)纯化。由此，获得化合物(13c)：(S)-1-(叔丁基二苯基 甲硅烷基氧基)-5-(三甲基甲硅烷基)戊-4-炔-2-醇)(2.2177g，5.4mol，67％)， 为无色透明液体。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.56-7.35(4H，m)，7.34-7.18(6H，m)， 3.79-3.75(1H，m)，3.62(2H，ddd，J＝25.6Hz，10.4Hz，4.4Hz)，2.41-2.38(2H，t， J＝6.4Hz)，0.96(9H，s)，0.00(9H，s).¹³C NMR(CDCl₃)δ：135.5，129.8，127.8， 102.7，87.1，70.2，66.4，44.4，26.8，19.3，0.00

<1.3.合成方法1中的合成路线(c)>

在氩气氛下，将咪唑(1.103g，16.2mmol)，DMF(25ml)和TBDMSCl (1.238g，8.01mmol)加入到50ml梨形烧瓶中，并搅拌。在搅拌之后，将所 得溶液用作溶液(B)。在氩气氛下将化合物(13c)(2.2177g，5.4mmol)和 DMF(25ml)加入到50ml回收烧瓶中，并搅拌。然后加入溶液(B)，并将 所得混合物反应过夜。第二天，在观察到原料的样点消失之后，产物用乙 酸乙酯和蒸馏水萃取，以回收有机层。该有机层用饱和碳酸氢钠和饱和盐 溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥。利用真空蒸发器使所得产物减压并浓缩， 并将剩余物分离并且通过硅胶柱色谱(己烷∶乙酸乙酯＝20∶1)纯化。由此，获 得化合物(13d)：(S)-2，2，3，3，9，9-六甲基-8，8-二苯基-5-(3-(三甲基甲硅烷基)丙 -2-炔基)-4，7-二氧杂-3，8-二硅杂癸烷)(1.7713g，3.8mmol，62％)，为浅黄色 液体。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.56-7.53(4H，m)，7.31-7.22(6H，m)， 3.75-3.70(1H，m)，3.51(1H，dd，J＝10.2Hz，4.6Hz)，3.42(1H，dd，J＝10.4Hz， 6.0Hz)，2.54(1H，dd，J＝17.0Hz，5.4Hz)，2.25(1H，dd，J＝17.0Hz，7.0Hz)， 0.96-0.88(9H，m)，0.77-0.67(9H，m)，0.047-0.00(9H，m)，-0.07(3H，s)， -0.15(3H，s).¹³C NMR(CDCl₃)δ：135.5，129.5，127.6，104.7，85.7，71.8，67.0， 26.7，25.7，19.2，18.0，0.00，-4.67.

<1.4.合成方法1中的合成路线(d)>

在氩气氛下将化合物(13d)(1.7713g，3.37mmol)溶解在无水MeOH (35ml)中，并与CH₃ONa(2.37ml，4.39mmol)反应。在常温下反应大约1 小时并且接着通过TLC观察到原料的样点消失之后，产物用乙酸乙酯和 蒸馏水萃取，以回收有机层。该有机层用饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤， 并用无水硫酸钠干燥。利用真空蒸发器使所得产物减压并浓缩，并且获得 化合物(13e)：(S)-2，2，3，3，9，9-六甲基-8，8-二苯基-5-(丙-2-炔基)-4，7-二氧杂 -3，8-二硅杂癸烷)(1.4488g，3.2mmol95％)，为无色透明液体。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.56-7.53(4H，m)，7.29-7.23(6H，m)， 3.78-3.75(1H，m)，3.52(2H，ddd，J＝21.2Hz，10.1Hz，5.5Hz)，2.52(1H，ddd， J＝16.8Hz，5.5Hz，2.8Hz)，2.29(1H，ddd，J＝16.7Hz，6.2Hz，2.7Hz)，1.86(1H，t， J＝2.7Hz)，0.98(9H，s)，0.79(9H，s)，0.00(3H，s)，-0.08(3H，s).¹³C  NMR(CDCl₃)δ：135.5，129.7，127.8，81.8，71.7，69.7，66.9，26.8，25.8，24.4， 19.3，18.1，-4.72.

<1.5.合成方法1中的合成路线(e)>

将化合物(22)(0.70g，2.78mmol)和化合物(13e)(1.93g，1.2eq.)溶解在 DMF(27.8ml)中。加入Pd(PPh₃)₄(0.16g，0.05eq.)和CuI(0.053g，0.1eq.) 并搅拌，然后加入TEA(0.97ml，2.5eq.)。混合物在40℃反应。在搅拌过 夜之后，反应溶液用EtOAc硅藻土过滤。在过滤之后，滤液用EtOAc和 H₂O萃取以回收有机层。有机层用NaHCO₃aq.和NaCl aq.洗涤，并使用真 空蒸发器浓缩。将剩余物分离并通过硅胶柱色谱法(使用中性二氧化硅，洗 脱溶剂：CHCl₃∶CH₃OH＝100∶1)纯化。由此，获得偶联体(23)：(S)-5-(4-(叔丁 基二甲基甲硅烷基氧基)-5-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧基)戊-1-炔基)-1-甲基 嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮)(收率：1.62g)。

¹H NMR(CDCl₃)δ：8.68(1H，s)7.95(1H，s)7.63-7.10(10H， m)3.88-3.86(3H，t，J＝5.96，5.04)3.63-3.59(1H，dd，J＝5.04，5.04)3.56-3.52(1H， dd，J＝5.96，5.96)3.27(3H，s)2.78-2.72(1H，dd，J＝5.96，5.52)2.55-2.49(1H，dd， J＝6.44，6.44)0.98(9H，s)0.80(9H，s)-0.00(3H，s)-0.07(3H，s)¹³C  NMR(CDCl₃)：161.8，149.9，146.8，135.6，132.0，127.6，100.5，92.6，71.7，67.1， 64.3，36.1，31.4，26.8，25.7，19.2，18.0，-4.65

<1.6.合成方法1中的合成路线(f)>

将偶联体(23)(1.62g，2.78mmol)溶解在THF(11.2ml)中，然后加入1 mol/l TBAF(5.88ml，2.1eq.)并搅拌过夜。使用TLC来确认反应终止，并 使所得产物减压和浓缩。之后，将剩余物分离并通过硅胶柱色谱法(中性二 氧化硅，仅CHCl₃至CHCl₃∶MeOH＝15∶1)纯化。由此，获得核苷类似物(1)(收 率：0.33g，52.2％)。

¹H NMR(DMSO)δ：7.94(1H，s)4.84-4.82(1H，d，J＝4.88)4.60-4.57(1H，t， J＝5.84-5.60)3.60-3.56(1H，dd，J＝5.84，5.60)3.39-3.35(1H，dd)3.31(1H， s)3.17-3.13(1H，dd)2.54-2.50(1H，dd)2.40-2.35(1H，dd)

[实施例2]

<2.核苷类似物(3)的合成：(S)-5-(6-氨基吡啶-3-基)戊-4-炔-1，2-二 醇)>

核苷类似物(3)借助于以下[化学式6]中所示的合成方法2进行合成。

[化学式6]

<2.1.合成方法2中的合成路线(a)>

将糖部分(13e)(0.76g，3.45mmol)和碱基部分(28)(1.87g，1.3eq.)加入 到烧瓶中，并溶解在DMF(35.0ml)中，加入Pd(PPh₃)₄(0.40g，0.1eq.)和 CuI(0.13g，0.2eq.)并搅拌，然后加入TEA(1.20ml，2.5eq.)以在45℃进行 反应。在搅拌过夜之后，反应溶液用EtOAc进行硅藻土过滤。在过滤之后， 滤液用EtOAc和H₂O萃取以回收有机层。有机层用NaHCO₃aq.和NaCl aq. 洗涤，并使用真空蒸发器浓缩。将剩余物分离并通过硅胶柱色谱法(使用中 性二氧化硅，并且CHCl₃作为洗脱溶剂)纯化。由此，获得偶联体(29)： (S)-5-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧基)戊 -1-炔基)吡啶-2-胺)(收率：1.35g，71.5％)。

<2.2.合成方法2中的合成路线(b)>

将偶联体(29)(1.0g，1.73mmol)溶解在THF(17.3ml)中，然后加入1 mol/l TBAF(3.6ml，2.1eq.)。混合物搅拌过夜。之后，除去溶剂，并将剩 余物分离并且通过硅胶柱色谱法(使用中性二氧化硅，洗脱溶剂： CHCl₃∶MeOH＝1∶0及以上)纯化。由此，获得核苷类似物(3)(收率：0.47g)。

[实施例3]

<3.核苷类似物(5)的合成：(S)-2-氨基-5-(4，5-二羟基戊-1-炔基)嘧啶 -4(1H)-酮>

核苷类似物(5)借助于以下[化学式7]中所示的合成方法3进行合成。

[化学式7]

<3.1.合成方法3中的合成路线(a)>

将化合物(16)：5-碘-1，3-二甲基尿嘧啶(0.5g，1.88mmol)，PdCl₂(PPh₃)₂(10.99mg，0.01566mmol)，CuI(5.965mg，0.03132mmol)，化合物 (13e)(0.71g，1.566mmol)和DMF(10ml)依此顺序加入到烧瓶中并搅拌17 小时。在确认反应完成之后，反应产物用乙酸乙酯和蒸馏水萃取，以回收 有机层。该有机层用饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤，并用无水硫酸钠干 燥。使用真空蒸发器使有机层减压并浓缩。将剩余物分离并通过硅胶柱色 谱法(洗脱溶剂：氯仿∶甲醇＝100∶1)纯化。由此，获得化合物(17)：(S)-5-(4-(叔 丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧基)戊-1-炔基)-1，3- 二甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(收率：0.4715g，0.8mmol，51％，黄色液体)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.70-7.63(4H，m)，7.40-7.37(6H，m)， 3.96-3.90(1H，m)，3.69-3.66(1H，dd，J＝10.4Hz，4.8Hz)，3.63-3.59(1H，dd， J＝10.4Hz，4.8Hz)，3.37(6H，s)，2.85-2.79(1H，dd，J＝13.8Hz，6.00Hz)， 2.60-2.55(1H，dd，J＝13.8Hz，6.00Hz)，1.04(9H，s)，0.83(9H，s)，0.06(3H，s)， 0.00(3H，s)

<3.2.合成方法3中的合成路线(b)>

将盐酸胍(24.8g，0.2596mol)和乙醇钠(12.37g，0.182mol)溶解在无水 乙醇(100ml)中，并搅拌40分钟。然后所得混合物进行硅藻土过滤。使用 真空蒸发器使滤液减压并浓缩。将所获得的油状物转移到两径回收烧瓶中。 将Dimroth连接于该两径回收烧瓶。向该两径回收烧瓶中，加入溶解在无 水乙醇(100ml)中的化合物17(1.534g，2.60mmol)，并在将温度维持在96℃ 的同时搅拌1.5小时。在反应完成后，使用真空蒸发器使反应溶液减压并 浓缩。将获得的剩余物分离并通过硅胶柱色谱法(氯仿∶甲醇＝100∶1)纯化。 由此，获得化合物(18)：(S)-2-氨基-5-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5-(叔 丁基二苯基甲硅烷基氧基)戊-1-炔基)嘧啶-4(1H)-酮)(0.813g，1.45mmol， 56％，黄色液体)。

<3.3.合成方法3中的合成路线(c)>

在氩气氛下将化合物(18)(0.793g，1.41mmol)溶解在无水MeOH(40 ml)中，然后加入12mol/l HCl(0.353ml，4.23mmol)。所获得的混合物在油 浴中在将温度维持在60℃的同时搅拌4小时。在反应之后，使用真空蒸 发器使反应产物减压并浓缩以获得核苷类似物(5)。该核苷类似物(5)不经后 处理进行下一反应。

[实施例4]

<4.核苷类似物(10)的合成：(S)-5-(蒽-9-基)戊-4-炔-1，2-二醇>

核苷类似物(10)借助于以下[化学式8]中所示的合成方法4进行合成。

[化学式8]

<4.1.合成方法4中的合成路线(a)和(b)>

向其中倒入了化合物(13e)(0.86g，1.89mmol)的烧瓶中，将 PdCl₂(CH₃CN)₂(19.6mg，75.6μmol)，X-Phos(108mg，227μmol)，Cs₂CO₃(1.60g，4.92mmol)，和9-氯蒽(1.21g，5.6mmol)依此顺序放入，然后加入乙 腈(15ml)进行溶解。所得混合物在90℃反应。在反应过夜之后，反应产 物用乙酸乙酯和H₂O萃取。收集水层，并再次用乙酸乙酯和H₂O萃取。 收集有机层，并用无水硫酸钠干燥。使溶剂减压并蒸掉。(b)将所获得的剩 余物溶解在THF(15ml)中，并倒入TBAF(7.1ml，7.11mmol)并且搅拌。 在反应完成之后，使溶剂减压并蒸掉。剩余物通过硅胶柱色谱法(己烷∶乙 酸乙酯＝1∶1)纯化，并且使洗脱液减压并蒸掉。由此，获得核苷类似物(10) (收率：0.14g，26％，褐色固体)。

¹H NMR(400MHz，CHCl₃)δ：1.97-2.00(m，1H，C1-Hα)，2.52-2.53(m，1H， C1-Hβ)，3.02-3.04(m，2H，OH)，3.81-3.85(dd，1H，C3-Hα，J＝5.52，11.5Hz)， 3.95-3.99(dd，1H，C3-Hβ，J＝5.68，11.5Hz)，4.14-4.20(m，1H，C2-H)， 7.25-7.28(m，2H，蒽)，7.49-7.56(m，3H，蒽)，7.99-8.01(m，2H，蒽)， 8.41-8.51(m，2H，蒽)

[实施例5]

<5.核苷类似物(11)的合成：(S)-5-(4-(3-(三氟甲基)-3H-二氮丙啶-3- 基)苯基)戊-4-炔-1，2-二醇>

核苷类似物(11)借助于以下[化学式9]中所示的合成方法5进行合成。

[化学式9]

<5.1.合成方法5中的合成路线(a)>

在氩气氛下，将充分干燥的化合物(33)：4’-碘-2，2，2-三氟苯乙酮(0.18g， 0.60mmol)倒入烧瓶中。然后，加入PdCl₂(PPh₃)₂(0.017g，0.024mmol，0.04 eq.)和CuI(0.009g，0.048mmol，0.08eq.)，并溶解在DMF(3ml)中。向此烧 瓶中，加入溶解在DMF(3ml)和TEA(0.25ml，1.8mmol，3.0eq.)中的充分 干燥的化合物(13e)(0.30g，0.66mmol，1.1eq.)，并在80℃搅拌以引发反 应。在搅拌过夜然后确认反应完成之后，使反应溶液进行硅藻土过滤以减 压并除去挥发性物质。所获得的剩余物用乙酸乙酯和H₂O萃取。有机层用 饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥。使溶剂减压并蒸 掉。剩余物通过硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝100∶1)纯化。由此，获得化 合物(34)：(S)-1-(4-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5-(叔丁基二苯基甲硅 烷基氧基)戊-1-炔基)苯基)-2，2，2-三氟乙酮)(0.19g，0.29mmol，50％，褐色 油状)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：-0.074(s，3H，-TBDMS)，-0.012(s，3H， -TBDMS)，0.79(s，9H，-TBDMS)，0.97(s，9H，-TBDPS)，2.42-2.48(q， J＝10.4Hz，1H)，2.69-2.75(q，J＝12.2Hz，1H)，3.56-3.62(m，1H)，3.64-3.85(m， 2H)，7.25-7.64(m，10H，-TBDPS)，7.61-7.62(d，2H)，7.91-7.93(d，2H).¹⁹F  NMR(372MHz，CDCl₃)δ：-87.4(s，3F，-CF₃).

<5.2.合成方法5中的合成路线(b)>

在氩气氛下，将化合物(34)(0.19g，0.2mmol)和HONH₂·HCl(0.040g， 0.58mmol，2.0eq.)加入到烧瓶中，并溶解在无水EtOH(3ml)和无水吡啶(3 ml)中。所得混合物在60℃搅拌以引发反应。在反应过夜之后，反应产物 用氯甲烷和蒸馏水萃取。有机层用饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤，并用 无水硫酸钠干燥以减压和蒸掉溶剂。所获得的剩余物溶解在适量的 CH₂Cl₂中。向烧瓶中，加入TEA(0.24ml，1.7mmol，4.0eq.)和TsCl(0.083g， 0.44mmol，1.5eq.)。然后，以少量加入作为催化剂的DMAP以在室温引发 反应。在反应过夜之后，使挥发性物质减压并除去，并且所获得的剩余物 用氯仿和H₂O萃取。有机层用饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤，并用无水 硫酸钠干燥。使溶剂减压并蒸掉。剩余物通过硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙 酯＝100∶1)纯化。由此，获得化合物(35)：(S)-1-(4-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷 基氧基)-5-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧基)戊-1-炔基)苯基)-2，2，2-三氟乙酮O- 甲苯磺酰基肟)(0.11g，0.13mmol，48％，白色固体)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：-0.074(s，3H，-TBDMS)，-0.012(s，3H， -TBDMS)，0.79(s，9H，-TBDMS)，0.97(s，9H，-TBDPS)，2.42-2.48(q， J＝10.4Hz，1H)，2.47-2.49(d，3H，-Ts)，2.69-2.75(q，J＝12.2Hz，1H)， 3.56-3.62(m，1H)，3.64-3.85(m，2H)，7.25-7.64(m，10H，-TBDPS)， 7.40-7.69(m，4H，-Ts)，7.61-7.62(d，2H)，7.91-7.93(d，2H).¹⁹F NMR(372MHz， CDCl₃)δ：-91.5(s，3F，-CF₃).

<5.3.合成方法5中的合成路线(c)>

在氩气氛下，将密封管冷却至-78℃。之后，将化合物(34)(0.11g，0.13 mmol)倒入该密封管中。然后，加入THF(4ml)用于溶解。将适量的NH₃气体吹入溶液中，密封该管，并在常温下进行搅拌2天。在冷却至-78℃ 之后，打开管，并恢复到常温以挥发过量NH₃气体。使用真空蒸发器使挥 发性溶剂减压并浓缩。剩余物通过硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝9∶1)纯化。 由此，获得化合物(36)：(S)-3-(4-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5-(叔丁基 二苯基甲硅烷基氧基)戊-1-炔基)苯基)-3-(三氟甲基)二氮杂环丙烷 (diaziridine)(0.79g，2.95mmol，80％，褐色油状物)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：-0.074(s，3H，-TBDMS)，-0.012(s，3H， -TBDMS)，0.79(s，9H，-TBDMS)，0.97(s，9H，-TBDPS)，2.42-2.48(q， J＝10.4Hz，1H)，2.12-2.74(m，2H，-NH-NH-)，2.69-2.75(q，J＝12.2Hz，1H)， 3.56-3.62(m，1H)，3.64-3.85(m，2H)，7.25-7.64(m，10H，-TBDPS)，7.61-7.62(d， 2H)，7.91-7.93(d，2H).¹⁹F NMR(372MHz，CDCl₃)δ：-91.2(s，3F，-CF₃).

<5.4.合成方法5中的合成路线(d)>

在氩气氛下，将化合物(36)(0.51g，0.80mmol)溶解在无水MeOH(16 ml)中。在避光条件下，加入TEA(0.30ml，2.0mmol，2.5eq.)和I₂(0.22g， 0.88mmol，1.1eq.)，以引发反应。在30分钟之后，确认原料消失。然后， 反应产物用二乙醚和硫代硫酸钠萃取。回收有机层，用饱和碳酸氢钠和饱 和盐溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥。使溶剂减压并蒸掉。剩余物通过硅 胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝40∶1)纯化。由此，获得化合物(37)： (S)-3-(4-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-5-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧基) 戊-1-炔基)苯基)-3-(三氟甲基)-3H-二氮丙啶)(0.48g，0.75mmol，93％，无 色晶体)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：-0.073(s，3H，-TBDMS)，0.00(s，3H， -TBDMS)，0.79(s，9H，-TBDMS)，0.99(s，9H，-TBDPS)，2.49-2.55(q，1H)， 2.75-2.80(q，1H)，3.53-3.64(m，1H)，3.86-4.03(m，2H)，7.01-7.04(d，2H)， 7.19-7.37(m，10H，-TBDPS)，7.60-7.63(d，2H).¹⁹F NMR(372MHz， CDCl₃)δ：-80.9(s，3F，-CF₃).

<5.5.合成方法5中的合成路线(e)>

在氩气氛下，将化合物(37)(0.44g，0.68mmol)加入到烧瓶中，并加入 THF(13.6ml)用于溶解。然后，加入1.0mol/l TBAF(1.42ml，1.42mmol，2.1 eq.)以在室温引发反应。在2小时之后，确认原料消失。然后使溶剂减压 并蒸掉。获得的剩余物通过硅胶柱色谱法(氯仿∶甲醇＝50∶1)纯化。由此， 获得核苷类似物(11)(0.18g，0.64mmol，94％，无色晶体)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：2.65-2.67(m，2H，-OH)，3.63-3.67(q，2H)， 3.78-3.81(q，1H)，3.95-3.97(m，2H)，7.08-7.10(d，2H)，7.38-7.41(d，2H).¹⁹F  NMR(372MHz，CDCl₃)δ：-80.9(s，3F，-CF₃).

[实施例6]

<6.合成核苷类似物(1)的亚磷酰胺体(25)：(S)-1-(双(4-甲氧基苯基)(苯基) 甲氧基)-5-(1-甲基-2，4-二氧代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-基)戊-4-炔-2-基2-氰基 乙基二异丙基亚磷酰胺>

亚磷酰胺体(25)借助于以下[化学式10]中所示的合成方法6进行合成。

[化学式10]

<6.1.合成方法6中的合成路线(a)>

将核苷类似物(1)(0.33g，1.47mmol)倒入烧瓶中，并加入吡啶(7.25ml) 用于溶解。然后，加入DMTrCl(0.54g，1.1eq.)并搅拌。在2小时之后，通 过TLC确认原料消失。所得产物用EtOAc和H₂O萃取以回收有机层。该 有机层用NaHCO₃aq.和NaCl aq.洗涤，并使溶剂减压并蒸掉。将剩余物分 离并通过硅胶柱色谱法(中性二氧化硅，CHCl₃至CHCl₃∶MeOH＝100∶1)纯化。 由此，获得化合物(24)：(S)-5-(5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-4-羟基戊 -1-炔基)-1-甲基嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(收率：0.33g，43.7％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ：8.07(1H，s)7.45-7.40，7.34-7.20，6.84-6.82(14H， m)3.99-3.97(1H，dd)3.80(6H，s)3.38(3H，s)3.26-3.24(2H，m)2.70-2.67(1H， dd)2.51-2.49(1H，d，J＝5.21)

<6.2.合成方法6中的合成路线(b)>

在氩气氛下，将化合物(24)(0.23g，0.44mmol)加入到烧瓶中，并溶解 在无水THF(2.2ml)中。然后，加入DIPEA(0.39ml，2.20mmol，5.0eq.)和 亚磷酰胺试剂(0.20ml，0.88mmol，2.0eq.)并搅拌。在30分钟之后，通过 TLC确认反应完成。然后，反应产物用CHCl₃萃取以回收有机层。该有机 层用NaHCO₃aq.和NaCl aq.洗涤，并且使溶剂减压并蒸掉。剩余物通过硅 胶柱色谱法(EtOAc∶己烷＝1∶3)纯化。由此获得亚磷酰胺体(25)(收率：0.20g， 63.7％³¹P NMR(100MHz)δ：149.1)。

[实施例7]

<7.合成核苷类似物(3)的亚磷酰胺体(32)：(S)-N’-(5-(5-(双(4-甲氧基苯 基)(苯基)甲氧基)-4-羟基戊-1-炔基)吡啶-2-基)-N，N-二甲基甲脒2-氰基乙 基二异丙基亚磷酰胺>

亚磷酰胺(32)借助于以下[化学式11]中所示的合成方法7进行合成。

[化学式11]

<7.1.合成方法7中的合成路线(a)>

将核苷类似物(3)(0.47g，1.73mmol)倒入烧瓶中，并加入DMF(17.3 ml)用于溶解。然后，加入DMF-DMA(1.15ml，5.0eq.)并在45℃搅拌过夜。 之后，使溶剂减压并蒸掉。由此，获得化合物(30)：(S)-N’-(5-(4，5-二羟基 戊-1-炔基)吡啶-2-基)-N，N-二甲基甲脒。

<7.2.合成方法7中的合成路线(b)>

将化合物(30)(1.73mmol)加入到烧瓶中，并溶解在吡啶(25ml)中。然 后，加入DMTrCl(0.64g，1.1eq.)并搅拌5小时30分钟。所得产物用EtOAc 和H₂O萃取，并用NaHCO₃aq.和NaCl aq.洗涤。然后，将洗涤过的产物 分离并通过硅胶柱色谱法纯化。由此，获得化合物(31)：(S)-N’-(5-(5-(双(4- 甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-4-羟基戊-1-炔基)吡啶-2-基)-N，N-二甲基甲脒。

<7.3.合成方法7中的合成路线(c)>

化合物(31)的亚磷酰胺体(32)以类似于亚磷酰胺体(25)的合成方法获 得。

[实施例8]

<8.合成核苷类似物(5)的亚磷酰胺体(21)：(S)-1-(双(4-甲氧基苯 基)(苯基)甲氧基)-5-(2-((E)-(二甲基氨基)亚甲基氨基)-4-氧代-1，4-二氢嘧啶 -5-基)戊-4-炔-2-基2-氰基乙基二异丙基亚磷酰胺>

亚磷酰胺(21)借助于以下[化学式12]中所示的合成方法8进行合成。

[化学式12]

<8.1.合成方法8中的合成路线(a)>

在氩气氛下将核苷类似物(5)(0.29g，1.41mmol)倒入烧瓶中，并溶解 在无水DMF(14ml)中。在该溶液中，加入N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩 醛)(1.12ml，8.46mmol)。在油浴中将温度维持在40℃的同时将混合物搅 拌大约5小时。使用真空蒸发器使反应溶液减压并浓缩以获得化合物(19)。 由此，该化合物(19)：(S，E)-N’-(5-(4，5-二羟基戊-1-炔基)-4-氧代-1，4-二氢嘧 啶-2-基)-N，N-二甲基甲脒未经后处理用于下一反应。

<8.2.合成方法8中的合成路线(b)>

在氩气氛下将化合物(19)(0.37g，1.41mmol)倒入烧瓶中，并溶解在无 水吡啶(10ml)中。在该溶液中，加入DMTrCl(0.62g)，并搅拌大约5小时。 使用真空蒸发器使反应溶液减压并浓缩。由此，获得化合物(20)： (S，E)-N’-(5-(5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-4-羟基戊-1-炔基)-4-氧代 -1，4-二氢嘧啶-2-基)-N，N-二甲基甲脒。该化合物(20)未经后处理用于下一 反应。

<8.3.合成方法8中的合成路线(c)>

在氩气氛下将化合物(20)(0.1952g，0.344mmol)倒入烧瓶中，并溶解 在THF(1.72ml，0.2mol/l)中。接下来，加入DIPEA(0.36ml，2.06mmol，6 eq.)并搅拌，并逐滴加入i-Pr₂NP(Cl)OCE(0.15ml，2.06mmol，2eq.)。在1 小时之后，将氯仿加入反应溶液中以回收有机层。该有机层用饱和碳酸氢 钠和饱和盐溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥。然后使溶剂减压并蒸掉。将 剩余物分离并通过硅胶柱色谱法(仅乙酸乙酯)纯化，并蒸掉溶剂。由此， 获得亚磷酰胺体(21)，为黄色晶体。

[实施例9]

<9.合成核苷类似物(10)的亚磷酰胺体(102)：(S)-5-(蒽-9-基)-1-(双(4-甲氧 基苯基)(苯基)甲氧基)戊-4-炔-2-基2-氰基乙基二异丙基亚磷酰胺>

亚磷酰胺(101)借助于以下[化学式13]中所示的合成方法9进行合成。

[化学式13]

<9.1.合成方法9中的合成路线(a)>

将核苷类似物(10)(0.14g，0.49mmol)倒入烧瓶中，并溶解在吡啶(2 ml)中。在该溶液中，倒入DMTrCl(0.19g，0.55mmol)，然后搅拌。在1 小时后，加入甲醇(1ml)以终止反应。反应溶液用乙酸乙酯、水和NaHCO₃进行液体分离以回收有机层。该有机层用饱和盐溶液洗涤，并且用无水硫 酸钠干燥。使溶剂减压并蒸掉。剩余物通过硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯 ＝5∶1)纯化，并使溶剂减压并蒸掉。由此获得化合物(101)：(S)-5-(蒽-9- 基)-1-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)戊-4-炔-2-醇(橙色泡沫状物质，收率： 0.28g(98％))。

¹H NMR(400MHz，CHCl₃)δ：2.57-2.58(d，1H，OH，J＝4.60Hz)， 3.05-3.07(d，2H，C1-H2，J＝6.40Hz)，3.43-3.54(m，2H，C3-H2)，3.66(s，6H， OMe)，4.20-4.21(m，1H，C2-H)，6.75-6.79(m，5H，苯)，7.24-7.50(m，13H，苯)， 7.98-8.00(m，2H，苯)，8.39-8.47(m，3H，苯)

<9.2.合成方法9中的合成路线(b)>

将化合物(101)(0.26g，0.46mmol)倒入烧瓶中，并溶解在THF(2.3ml) 中。在该溶液中，加入DIPEA(0.4ml)和亚磷酰胺试剂(0.21ml)，并在室温 搅拌。在搅拌45分钟之后，混合物用氯仿萃取以回收有机层。该有机层 用饱和碳酸氢钠和饱和盐溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥。使溶剂减压并 蒸掉，并且剩余物通过硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)纯化。由此，获 得化合物(102)：(S)-5-(蒽-9-基)-1-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)戊-4-炔 -2-基2-氰基乙基二异丙基亚磷酰胺(橙色泡沫状物质，收率：0.28g (78％))。

³¹P NMR(400MHz，CDCl₃)δ：149.18

[实施例10]

<10.合成核苷类似物(11)的亚磷酰胺体(39)：(S)-1-(双(4-甲氧基苯基)(苯 基)甲氧基)-5-(4-(3-(三氟甲基)-3H-二氮丙啶-3-基)苯基)戊-4-炔-2-基氰基 甲基二异丙基亚磷酰胺>

亚磷酰胺体(39)借助于以下[化学式14]中所示的合成方法10进行合 成。

[化学式14]

<10.1.合成方法10中的合成路线(a)>

在氩气氛下将核苷类似物(11)(0.36g，1.26mmol)倒入烧瓶中，并溶解 在吡啶(7.2ml)中。然后在冰冷条件下逐渐地加入DMTrCl(0.47g，1.38 mmol，1.1eq.)。在5小时之后，所得混合物用饱和NaHCO₃和饱和NaCl 萃取，并洗涤。在用硫酸钠干燥有机层之后，使溶剂减压并蒸掉。剩余物 通过硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化。由此，获得化合物(38)： (S)-1-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)-5-(4-(3-(三氟甲基)-3H-二氮丙啶-3- 基)苯基)戊-4-炔-2-醇(0.73g，1.24mmol，98％，黄色晶体)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：2.65-2.67(m，2H，-OH)，3.63-3.67(q，2H)， 3.72(s，6H，-DMTr)，3.78-3.81(q，1H)，3.95-3.97(m，2H)，7.08-7.10(d，2H)， 7.38-7.41(d，2H).6.72-7.47(m，16H，DMTr).¹⁹F NMR(372MHz， CDCl₃)δ：-81.1(s，3F，-CF₃)

<10.2.合成方法10中的合成路线(b)>

在Ar气氛下将化合物(38)(0.73g，1.24mmol)倒入烧瓶中，并溶解在 THF(6.2ml，0.2mol/l)中。加入DIPEA(1.08ml，6.19mmol，5.0eq.)并搅拌。 然后，滴加i-Pr₂NP(Cl)OCE(0.55ml，2.48mmol，2.0eq.)。在1小时后，加 入氯仿，并且饱和NaHCO₃和饱和NaCl用于进行萃取和洗涤以回收有机 层。在用硫酸钠干燥有机层之后，使溶剂减压并蒸掉。将剩余物分离并通 过硅胶柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝3∶1)纯化，并将溶剂蒸掉。由此，获得亚 磷酰胺体(39)(0.77g，0.98mmol，79％，黄色油状)。

³¹P NMR(400MHz，CDCl₃)δ：149.4¹⁹F NMR(372MHz，CDCl₃)δ：-82.0(s， 3F，-CF₃)

[实施例11]

<11.CPG树脂连接的核苷类似物(27)的合成>

CPG树脂连接的核苷类似物(27)借助于以下[化学式15]中所示的合成 方法11进行合成。

[化学式15]

<11.1.合成方法11中的合成路线(a)>

将化合物(24)(90mg，0.17mmol)和DMAP(0.42mg，0.02eq.)倒入烧瓶 中，并溶解在吡啶(1.7ml)中。然后，在Ar气氛下将琥珀酸酐(50mg，3.0eq.) 加入该溶液中，并在室温搅拌该混合物。在搅拌78小时之后，原料余留。 因此，加入少量DMAP并搅拌。反应在第二天终止，并萃取反应溶液以 回收有机层。使用真空蒸发器使有机层减压并浓缩。由此，获得琥珀酰体 (26)。

<11.2.合成方法11中的合成路线(b)>

将琥珀酰体(26)(113.2mg，0.18mmol)倒入烧瓶中，并溶解在DMF(4.5 ml，0.01mol/l)中。然后，将CPG树脂(0.38g，1.0eq.)和WSC(34.6mg，4.0 eq.，0.18mmol)快速加入到该溶液中，并摇晃3天。之后，用吡啶洗涤CPG 树脂。接着，帽化没有结合至琥珀酰体(26)的树脂。洗涤后的树脂加入到 在吡啶(15ml)中的0.1mol/l DMAP中，并摇晃过夜。在确认反应溶液变为 褐色之后，终止反应。在反应完成之后，使用吡啶、EtOH和CH₃CN以此 顺序洗涤树脂。由此，获得CPG树脂连接的核苷类似物(27)(活性：38.9 μmol/g)。

[实施例12]

[核苷类似物(1)的ε值的计算]

核苷类似物(1)的ε值以以下所示方法计算。

在将核苷类似物(1)(1.12mg)溶解在MilliQ(50ml)中以产生0.1 mmol/l水溶液之后，测量吸光度。然后，计算ε值。结果为ε260：2820和 ε290：8630.

正常胸腺嘧啶的ε260值为7400。然而，核苷类似物(1)含有炔，使得 最大吸收波长移动至293nm。

使用各种CPG树脂连接的核苷类似物或各种核苷类似物的亚磷酰胺 体，通过以下描述的固相亚磷酰胺方法合成寡核苷酸类似物。

[实施例13]

[固相亚磷酰胺方法]

在1μmol规模上进行寡核苷酸类似物的合成。使用3400DNA自动合 成仪。将正常亚磷酰胺和合成的亚磷酰胺类似物体溶解在MeCN中以分别 得到0.1mol/l和0.12mol/l，并且使用RNA方案进行合成。合成在DMTr 基团在寡核苷酸的5’末端处被除去的状态下完成。CPG树脂通过Ar气进 行干燥。将结合寡核苷酸的CPG树脂转移到样品贮存管中，并加入 (NH₄OH∶EtOH＝3∶1)。所获得的产物在室温摇晃12小时，由此除去CPG树 脂。将反应溶液转移到Eppendorf管，并在减压下固体干燥。此外，将TBAF 加入到剩余物中，并使产物经过在室温下摇晃的去保护处理达12小时。 将反应溶液稀释在0.1mol/l TEAABuf.(30ml)中，并将所获得溶液部分地 通过C18反相柱色谱法(Sep-Pak)纯化。在剩余物中，加入200μl的加样溶 液(90％甲酰胺，在1×TBE中)，并且期望的寡核苷酸通过20％PAGE分离。 切掉期望寡核苷酸的凝胶带。然后，将该凝胶带加入到0.1mol/l TEAA水 溶液和0.1mol/l EDTA水溶液(15ml)中的每一种中，并将所得产物摇晃过 夜。滤液通过C18反相柱色谱法(Sep-Pak)纯化。将寡核苷酸溶解在H₂O(1 mL)中，并测量所获得的稀释溶液在260nm处的吸光度。由此，计算其收 率。纯化的寡核苷酸以30pmol的量进行固体干燥，并溶解在3μl的无菌 水中。然后，在该溶液与3μl基质溶液(matrix solution)充分混合之后，将 样品涂覆在板上。在样品固体干燥之后，其结构通过MALDI-TOF/MS鉴 别。

各个合成的寡核苷酸类似物的序列、计算的分子量(计算的)和 MALDI-TOF/MS测量结果(观察的)显示在表1中。

[表1]

这里，T^a表示核苷类似物(1)。

单体的ε值的十倍的值用作poly T^a的ε值。在MALDI-TOFMS中的poly  T^a的主峰表示作为Na加合物的2820.1的值。

[实施例14]

[Tm值的计算1]

在合成的寡核苷酸类似物中，具有互补DNA或RNA的双链的稳定性 通过热变性方法计算作为Tm值，并将计算的值与正常双链的值进行比较 (Δ℃)。

测量条件：5至85℃，样品浓度为12μmol/l，缓冲液包括10mmol/l磷 酸钠和100mmol/l NaCl。

在260nm处测得的Tm显示在[图1]和[表2]中。

[表2]

  Tm(℃) Δ℃ polyTa-dA 24.6 0.8 polyT-dA 23.8 - polyTa-rA 23.6 1.1 polyT-rA 22.5 -

作为结果，发现相比于正常胸腺嘧啶聚合物，Tm值增大，并且本发 明的类似物增加双链的热稳定性。这个结果表明核苷类似物(1)的均聚物 可用作纳米材料。

此外，焓差(ΔH°)和熵差ΔS°通过Van’t Hoff方程式计算，并且比较双 链的热力学稳定性。计算ΔH°和ΔS°的结果显示在[表3]中。

R＝8.315[kJ/mol]，4.1840kJ/mol＝1kcal/mol。

[表3]

  ΔH°[kcal/mol] ΔS°[cal/mol] Poly T-poly rA -63.3 -175.3 Poly T-poly dA -70.8 -214.7 Poly Ta-poly rA -55.1 -163.0 Poly Ta-poly dA -64.4 -192.5

作为结果，发现双链的稳定化主要取决于熵项。

接着，研究类似物T^a与RNA的的碱基特异性。制备各自在链的中央 引入了四种类型的碱基的互补链。然后，通过测量Tm比较双链彼此的稳 定性。

各个合成的寡核苷酸类似物的序列、计算的分子量(计算的)和 MALDI-TOF/MS测量结果(观察的)显示在[表4]中。

[表]

[实施例15]

[Tm值的计算2]

Tm测量的结果显示在[图2]和[表5]中。

测量条件：20至100℃，样品浓度为3μmol/l，缓冲液包括10mmol/l 磷酸钠和100mmol/l NaCl。

[表5]

Tm Δ℃ A-U：67.9 - A-Ta：64.3 -3.6 U-Ta：60.8 -7.1 C-Ta：58.6 -9.3 G-Ta：63.7 -4.2

此外，测量各自被核苷类似物(1)取代了两个碱基的寡核苷酸类似物的 Tm。

[实施例16]

[Tm值的计算3]

Tm测量的结果显示在[图3]和[表6]中。

[表6]

Tm Δ℃ A-2Ta：60.9 -7.0 U-2Ta：59.1 -8.8 C-2Ta：57.5 -10.4 G-2Ta：59.7 -8.2

如从以上结果看到的，在链的中央引入的糖部分开环的核苷类似物(1) 具有与正常碱基的氢键。即，该核苷类似物(1)具有碱基特异性。然而，该 核苷类似物(1)引起双链的热稳定性降低。

此外，合成了在寡核苷酸及其互补链中各自引入了合成的胞嘧啶类似 物Cz：核苷类似物(5)的18聚体(18mer)寡核苷酸。各个合成的寡核苷酸类 似物的序列、计算的分子量(计算的)和MALDI-TOF/MS测量结果(观察的) 显示在[表7]中。

[表7]

名称 序列 计算的 观察的 CZ1-ss 5′-d(GAAGGTCAAC_zGTATCTCT)-3′ 5480.6 5474.9 CZ2-ss 5′-d(GAAGGTCAAC_zC_zTATCTCT)-3′ 5422.5 5422.5 CZ3-ss 5′-d(GAAGGTCAC_zC_zC_zTATCTCT)-3′ 5380.5 5382.5 正常-as 5′-d(AGAGATAGGTTGACCTTC)-3′ 5538.6 5537.9 正常-as 5′-d(AGAGATAGGGTGACCTTC)-3′ 5563.6 5563.1

此外，使用以下所示的序列合成的寡核苷酸类似物和已有寡核苷酸如 以下所示结合。然后，测量它们的Tm值以进行比较。Tm测量的结果显 示在[表8]中。

[表8]

从以上结果，发现合成的糖部分开环胞嘧啶类似物Cz：核苷类似物(5) 可以选择错配而与互补链形成氢键。此外，获得了这样的结果，即热力学 稳定性类似于或优于正常核苷的热力学稳定性。甚至当该序列中央中引入 的糖部分开环胞嘧啶类似物Cz：核苷类似物(5)的数量增加至两个或三个 时，Tm值也没有显著变化。

[应用于miR199a]

MiR199a具有靶向HCV(丙型肝炎病毒)的序列。因此，将评述糖部分 开环的核苷类似物是否可以应用于miRNA，以及是否可以被利用以便改 善引导链选择性。即使引入所使用的核苷类似物(1)：类似物T^a中的一个或 多个，Tm值也将降低。因此，认为在miR199a中要引入的类似物的数量 至多每条链一个。而且，取决于psi199a5p载体或psi199a3p载体，基因表 达抑制能力不同。为什么使用psi199a3p载体特别增加表达抑制的原因被 认为是，在5’末端处存在的腺苷促进RISC的形成；以及在miR199a5p中 的两个位置处存在的突起区域促进双链离解成单链。另一个原因被认为 是，由于大量AU碱基对包含在miR199a3p的5’末端侧而GC碱基对主要 存在于miR199a5p的5’末端侧，使热力学稳定性不均衡。

由于认为引导选择性取决于各种因素，所以决定考察在所述类似物的 哪个区域上引入miR199a5p是最有效的。为此，在miR199a5p和miR199a3p 中的每一个中将一个碱基U用T^a替代，以便总共合成14个miRNA，并 用于测定。

[实施例17]

[miRNA199a的基因抑制能力的考察]

在各自具有靶向HCV的序列的miR199a3p和miR199a5p中，将不同 区域中的U用核苷类似物(1)：类似物T^a(在[表9]中指示为Y)替代。考察 由核苷类似物(1)引起的基因表达抑制能力的变化，该能力对于 miRNA199a的修饰区域是特异的。

合成的寡核苷酸的序列在以下显示。

[表9]

  序列 miR199a5p-<1> 5′-CCCAGYGUUCAGACUACCUGUUC-3′ miR199a5p-<3> 5′-CCCAGUGUYCAGACUACCUGUUC-3′ miR199a5p-<4> 5′-CCCAGUGUUCAGACYACCUGUUC-3′ miR199a5p-<6> 5′-CCCAGUGUUCAGACUACCUGYUC-3′ miR199a3p-<3> 5′-ACAGUAGUCUGCACAUYGGUUA-3′ miR199a3p-<5> 5′-ACAGUAGUCYGCACAUUGGUUA-3′ miR199a3p-<7> 5′-ACAGYAGUCUGCACAUYGGUUA-3′ miR199a5p 5′-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC-3′ miR199a3p 5′-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3′

使用合成的寡核苷酸类似物(miRNA<1>，miRNA<2>，miRNA<3>， miRNA<4>，miRNA<5>，miRNA<6>，miRNA<7>和miRNA<8>)，考察基因 表达抑制能力。

通过将miRNA<1>至miRNA<8>引入到各种HeLa细胞中并进行双重 荧光素酶报告基因测定(Dual-Luciferase reporter assay)来评估基因表达抑 制能力。

关于miRNA<1>至miRNA<8>的数据显示在[表10]中。[表10]中的 miR表示miRNA。在该表中，5p是衍生自pre-miRNA的5’侧上的臂的 miRNA，而3p是衍生自pre-miRNA的3’侧上的臂的miRNA。

[表10]

  miR199a5p miR199a3p miRNA<1> 正常 正常 miRNA<2> 5p<1> 正常 miRNA<3> 5p<3> 正常 miRNA<4> 5p<4> 正常 miRNA<5> 5p<6> 正常 miRNA<6> 正常 3p<3> miRNA<7> 正常 3p<5> miRNA<8> 正常 3p<7>

miRNA<1>用正常miR199a5p和正常miR199a3p形成。miRNA<2> 用miR199a5p-<1>和正常miR199a3p形成。miRNA<3>用miR199a5p-<3> 和正常miR199a3p形成。miRNA<4>用miR199a5p-<4>和正常miR199a3p 形成。miRNA<5>用miR199a5p-<6>和正常miR199a3p形成。miRNA<6> 用正常miR199a5p和miR199a3p-<3>形成。miRNA<7>用正常miR199a5p 和miR199a3p-<5>形成。miRNA<8>用正常miR199a5p和miR199a3p-<7> 形成。

考察基因表达抑制能力的结果显示在[图4A和4B]中。

发现含有糖部分开环的核苷类似物(1)：类似物T^a作为组分的miRNA 的基因表达抑制能力具有取决于miRNA的修饰区域的特异性。miRNA<2> 使用任一种载体都不显著抑制表达。miRNA<4>和<5>在3’末端侧上引入 类似物T^a，由此变得不稳定。因此，使其相反链的5’末端侧不稳定以作为 引导链被并入。因此，认为相比于正常miRNA，表达抑制能力得到改善， 并且可以抑制通过相反链的表达抑制。而且，在突起区域中具有修饰的 miRNA<3>具有优于正常miRNA的表达抑制能力，但其相反链也在一定 程度上抑制表达。观察到miRNA<6>由于与miRNA<4>和<5>相同的原因 而具有一定的链选择性，但该链选择性的程度较小。miRNA<7>和<8>也 表现出与正常miRNA相同水平的表达抑制，但观察到由其相反链引起的 一定程度的表达抑制。根据上述结果，认为通过在3’末端侧上引入修饰以 将其相反链并入RISC中，而不是在要变得不稳定的5’末端侧上引入修饰， 可以在不降低表达抑制能力的情况下获得链选择性。

[实施例18]

[核酸酶抗性的考察]

对于含有核苷类似物(1)作为组分的miRNA，通过蛇毒磷酸二酯酶 (SVP)来研究稳定性。含有核苷类似物(1)作为组分的miRNA是这样的单链 RNA，其中3’-突出端中的dT(胸腺嘧啶)被核苷类似物(1)替代。含有核苷 类似物(1)作为组分的miRNA以时间依赖性方式用SVP处理。在终止反应 之后，降解的RNA片段通过电泳进行分析。

分析结果显示在[图5A至5B]和[图6]中。[图6]中的Ta RNA是含有 核苷类似物(1)：T^a作为组分的miRNA。

保持为没有被降解的RNA以时间依赖性方式显示(从右侧开始，0min， 1min，5min，10min，30min，1h，3h，和6h)。酶反应期间的RNA浓度为1 μmol/l。尽管酶反应系统中使用的缓冲液没有限制，只要它是适用于酶的 缓冲液，但使用了tris-盐酸缓冲液。在过去一定时间之后，加入乙二胺四 乙酸(EDTA)，并在100℃加热2分钟以终止反应。通过凝胶电泳考察反应 之后的反应溶液，并且使用反相高效液相色谱(HPLC)测量保持为没有被降 解的RNA的存活率。

根据上述结果，如[图6]中所示，发现相比于正常miRNA，即使在已 过去5分钟之后，含有核苷类似物(1)：T^a作为组分的miRNA以50％以上 的比率保持为没有被降解；并且通过含有核苷类似物(1)作为组分增加了稳 定性。

[实施例19]

[应用于miRNA的核酸探针]

使用含有核苷类似物(11)作为组分的miRNA，利用核苷类似物(11)是 光反应性残基的事实，考察其互补链是否可以通过光照射被捕获。

将含有核苷类似物(11)作为组分的miRNA定义为No.2。将其中要与 核苷类似物(11)配对的碱基发生改变的互补链RNA定义为No.6，No.7和 No.8。这些互补链RNA中的每一个用No.2退火。

之后，在0℃的条件下，各个退火的样品用365nmm的UV照射以引 发交叉偶联反应。在每个时间间隔处取样品的5μml等分试样，并加入7 mol/l尿素溶液(4μml)和加样缓冲液(4μml)以终止反应。在终止反应之后， 通过变性凝胶电泳进行考察。

No.2，No.6，No.7和No.8的序列显示在[表11]中。No.2和各个RNA 之间的交叉偶联反应的结果显示在[图7]中。

[表11]

根据以上结果，发现特别是在RNA No.2和RNA No.8之间显著发生 交叉偶联反应。这个结果表明，含有核苷类似物(11)作为组分的miRNA可 以以序列特异方式捕获mRNA。因此，认为由miRNA靶向的mRNA的碱 基序列可以通过捕获由miRNA靶向的mRNA(参见图8)以及研究所捕获 的mRNA的序列而确定。

[其他实施方案]

尽管以上描述了本发明的实施方案，但是本发明不局限于上述实施方 案，并且可以以其他各种实施方案实现。

例如，可以合成核苷类似物(1)至(11)中之一作为组分的siRNA。

以下显示所合成的siRNA的序列。所合成的单链siRNA为各自含有 核苷类似物(1)作为组分的21聚体(21mer)RNA，以及各自含有核苷类似物 (10)作为组分的22聚体(22mer)RNA。

各自含有核苷类似物(1)作为组分的21mer RNA的序列显示在表12 中。在ON1和ON2中，在3’末端处的悬挂端区域中引入胸腺嘧啶。在 ON3和ON4中，在3’末端处的悬挂端区域中引入核苷类似物(1)。在ON8 中，在5’末端上引入核苷类似物(1)，并且在3’末端处的悬挂端区域中引入 胸腺嘧啶。在ON9中，在3’末端侧上引入核苷类似物(1)，并且在3’末端 处的悬挂端区域中引入胸腺嘧啶。

[表12]

RNA 序列 ON1 5′-CUUCUUCGUCGAGACCAUGtt-3′ ON2 5′-CAUGGUCUCGACGAAGAAGtt-3′ ON3 5′-CUUCUUCGUCGAGACCAUGT^aT^a-3′ ON4 5′-CAUGGUCUCGACGAAGAAGT^aT^a-3′ ON8 5′-CT^aUCUUCGUCGAGACCAUGtt-3′ ON9 5′-CUUCUUCGUCGAGACCAT^aGtt-3′

此外，如[表13]中所示，所合成的单链21mer siRNA与其互补链的序 列结合而形成双链。

[表13]

siRNA 正义 反义 siRNA<1> ON1 ON2 siRNA<2> ON3 ON4 siRNA<6> ON8 ON2 siRNA<7> ON9 ON2

siRNA<1>是正常siRNA，ON1是siRNA<1>的正义链并且ON2是 siRNA<1>的反义链。ON3是siRNA<2>的正义链并且ON4是siRNA<2> 的反义链。ON8是siRNA<6>的正义链并且ON2是siRNA<6>的反义链。 ON9是siRNA<7>的正义链并且ON2是siRNA<7>的反义链。

各自含有核苷类似物(10)作为组分的22mer siRNA的序列显示在表14 中。在正义和反义的每一个中，在5’末端侧上引入核苷类似物(10；E)。

[表14]

RNA 序列 计算的 观察的 OD 正常-正义 5’-CUUCUUCGUCGAGACCAUGtt-3’ 6921.3 6922.4 1.40 正常-反义 5’-CAUGGUCUCGAUGAAGAAGtt-3’ 7071.4 7071.2 4.39 正义 5’-ECUUCUUCGUCGAGACCAUGtt-3’ 6921.3 6922.4 4.11 反义 5’-ECAUGGUCUCGAUGAAGAAGtt-3’ 7071.4 7071.2 4.00

此外，如[表15]中所示，所合成的单链22mer siRNA与其互补链的序 列结合而形成双链。在siRNA正义(siRNAsense)中，正义链是正义的，而 反义链是正常反义的。在siRNA反义(siRNAantisense)中，正义链是正常 正义的，而反义链是反义的。Tm测量的结果显示在[图9]和[表15]中。

[表15]

根据Tm测量的结果，发现相比于正常siRNA，在正义链的5’末端侧 上含有核苷类似物(10)作为组分的siRNA和在反义链的5’末端侧上含有核 苷类似物(10)作为组分的siRNA二者的Tm值都增大，并且核苷类似物(10) 增加双链的热稳定性。

[基因表达抑制能力的考察]

对于[表13]中公开的siRNA<1>，siRNA<2>，siRNA<6>和siRNA<7> 以及[表15]中公开的siRNA正义和siRNA反义，考察基因表达抑制能力。

为了考察基因表达抑制能力，使用Psi验证载体。制备样品以使各个 siRNA为0.1，1.0和10nmol/l，并且将所制备的样品转染到HeLa细胞中。 然后，进行双重-荧光素酶报告基因测定以进行考察。siRNA<1>，siRNA<2>， siRNA<6>和siRNA<7>的基因表达抑制能力的结果显示在[图10]中，并且 siRNA正义和siRNA反义的基因表达抑制能力的结果显示在[图11]中。

如[图10]中所示，siRNA<2>呈现与正常siRNA<1>相同水平的基因表 达抑制能力，但当样品的浓度低时，基因表达抑制能力低于正常siRNA<1> 的基因表达抑制能力。而且，表明相比于正常siRNA，siRNA<6>的基因 表达抑制能力减小。认为这是因为在siRNA<6>中的正义链的5’末端侧上 引入核苷类似物(1)使得双链变得不稳定，由此促进正义链的并入。此外， 发现相比于正常siRNA，siRNA<7>具有高的基因表达抑制能力。认为这 是因为在siRNA<7>中的正义链的3’末端侧上引入核苷类似物(1)使得反义 链的5’末端侧变得不稳定，由此促进反义链的并入。

而且，如[图11]中所示，发现当样品浓度高时，相比于正常siRNA天 然(siRNAnative)，siRNA正义的基因表达抑制能力增大。发现相比于正常 siRNA天然，siRNA反义的基因表达抑制能力降低。

在上述实施方案中，核苷类似物(1)，(3)，(5)，(10)和(11)作为由通式(1)， (3)，(5)，(10)和(11)表示的核苷类似物的实例举例说明，并且详细描述了它 们的合成方法。然而，即使一些基团不同于所举例说明的核苷类似物(1)，(3)， (5)，(10)和(11)的那些基团，但是可以预期这样的核苷类似物具有类似作用 和效果，只要这些核苷类似物是由通式(1)，(3)，(5)，(10)和(11)表示的核苷类 似物。而且，这样的核苷类似物的合成方法几乎类似于用于所举例说明的 核苷类似物(1)，(3)，(5)，(10)和(11)的程序。

而且，核苷类似物(2)，(4)，(6)，(7)，(8)和(9)中的每一个可以几乎类似于 用于所举例说明的核苷类似物(1)，(3)，(5)，(10)和(11)的程序进行合成，仅仅 通过采用具有对应于这些核苷类似物的碱基部分的分子结构的原料即可。

更具体地，包括用甲硅烷基保护的羟基的糖部分和具有卤素取代基的 碱基部分在钯催化剂存在下经过偶联反应，而获得偶联体。之后，进行保 护基的去保护反应以及纯化过程。由此，可以合成具有由通式(2)，(4)，(6)， (7)，(8)和(9)中任一个表示的结构的核苷类似物。

此外，还实验性地考察了含有一个或多个由用于核苷类似物的通式 (2a)，(3a)至(9a)和(11a)中任一个表示的结构作为组分的siRNA的效果。获 得类似于在引入核苷类似物(1；Ta)和(10；E)的情况下的结果。

工业实用性

由于通过将根据本发明的核苷类似物引入到siRNA或miRNA中增大 了活性，所以对于开发RNA药物的应用变得可能。此外，通过将引入了 光反应性基团的核苷类似物引入，可以捕获mRNA。所述光反应性基团与 光发生反应并且提供能够共价键合的活性物种。因此，可以探寻药物开发 的靶标。

如果靶标基因或病毒的碱基序列是明确的，则利用根据本发明的寡核 苷酸类似物的治疗方法在理论上可以进行设计。因此，该治疗方法可以成 为被认为难以治愈的难治性疾病的新途径。

而且，本发明可以导致对通过参与RNA干扰的siRNA和miRNA的 基因控制机制的阐明。因此，在用于解决在生命科学领域中待解决的最重 要问题之一的研究中可以利用本发明。