一种筛选EphB4激酶活性抑制剂的转基因果蝇模型及其构建方法

摘要

本发明涉及一种筛选EphB4激酶活性抑制剂的转基因果蝇模型及其构建方法。将质粒注射到yw果蝇胚胎中，羽化的雌蝇与yw野生型雄蝇杂交后羽化的雄蝇与yw野生型雌蝇杂交，所得子代红眼雄性果蝇与雌性GMR-Gal4处女蝇杂交得子I代果蝇，挑子I代果蝇的处女蝇与yw/Y;+/Cyo雄蝇杂交，后代翘翅rougheye的雄蝇即为转基因果蝇模型中雄性果蝇；用所得雄性果蝇与+/FM7;+/Cyo雌性果蝇杂交，后代bar眼、翘翅、rougheye雌蝇再与模型中的雄性果蝇杂交，后代无bar眼、翘翅、rougheye的雌蝇即为转基因果蝇模型中雌性果蝇。本发明的果蝇模型可用于更快和方便的筛选有针对性的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型及其构建方法，尤其涉及一种转基因果蝇模型及其构建方法。

背景技术

Eph受体组成了受体酪氨酸激酶的最大家族，与它们的膜结合配体ephrin在胚胎图式形成、神经靶向、血管发育和成体新血管形成中发挥重要作用。有越来越多的证据表明Eph受体信号通路促进人体许多肿瘤的的发生，如直接促进肿瘤生长或通过形成肿瘤血管间接促进肿瘤形成。Eph受体及其配体在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤中被检测到过量表达。

特别是EphB4，它是Eph家族中研究的最多的蛋白。使用小干扰RNA或反义寡核苷酸链抑制EphB4的表达会进而抑制细胞的增殖、存活和PC3前列腺癌细胞的侵袭。使用可溶的EphB4的胞外结构域会抑制肿瘤生长。干扰内皮细胞中EphB4的信号通路会改变肿瘤血管的形态。这些观察提示我们EphB4在肿瘤及其血管生长中发挥重要作用。EphB4（又称HTK）和它的配体ephrinB2（HTKL），在血管和淋巴管网络的发育中发挥重要作用。EphB4特异表达在静脉上皮细胞，而ephrinB2在血管和淋巴管网络发育的早期阶段特异表达在动脉上皮细胞。小鼠中，EphB4基因的缺陷将会导致毛细血管连接的障碍，并最终导致小鼠在胚胎期死亡。胚胎发生中，EphB4表达在血细胞生成和血管发育的部位。EphB4在乳腺组织中的异常表达引起乳腺结构的无序、组织功能的损坏以及倾向于发生癌变。

Nai-Ying Yang等发现EphB4调节小鼠黑色素瘤细胞的迁移。恶性程度高的黑色素瘤细胞表达更高水平的EphB4，迁移的也比恶性程度低的快。当抑制EphB4的正向信号通路时，肿瘤细胞迁移也变慢。与此相比，活性EphB4的过表达明显增强了细胞的迁移能力。EphB4在细胞迁移和细胞形态上的效应需要它的激酶活性，当在细胞里过表达无激酶活性的EphB4时，细胞的迁移受到抑制。Nai-Ying Yang在文章中提到EphB4之所以可以调节细胞迁移是因为参与肌动蛋白的重新改造。Heroult M等甄选了一组人类肿瘤细胞系，并确定都有EphB4的表达。

由于易于饲养及便于遗传学操作，果蝇被成功的作为模式生物应用到发育遗传学、信号转导和细胞生物学的研究。高水平的基因和信号的保守性，以及哺乳动物与果蝇之间的细胞生理生化过程的相似性，使果蝇模型便于研究人类基因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种筛选EphB4激酶活性抑制剂的果蝇模型的构建方法。

为实现上述目的，本发明提供以下具体技术方案：

由雄性转基因果蝇与雌性GMR-Gal4的处女蝇杂交得到子I代果蝇，挑其所述子I代果蝇的的处女蝇与yw/Y;+/Cyo雄蝇杂交，后代挑选翘翅rough eye的雄蝇，即为果蝇模型中的雄性果蝇；用得到的果蝇模型中的雄性果蝇与+/FM7;+/Cyo杂交，后代挑选bar眼、翘翅、rough eye的雌蝇，得到的雌蝇再与果蝇模型中的雄性果蝇杂交，后代挑选无bar眼、翘翅、rough eye的雌蝇，即为果蝇模型中的雌性果蝇。

所述雄性转基因果蝇的基因型为EphB4 Kinase domain/Y或EphB4 Kinase domain。

所述雄性转基因果蝇是将5’端具有来自酵母上游激活序列的人EphB4 Kinase domain，整合到果蝇染色体基因组中得到的。

所述雄性转基因果蝇的制备方法为：

第一步，先进行载体的构建，即将PUAST 改造为 PUAST-EGFP载体。

第二步，将PUAST-EGFP改造为 PUAST-MYR-EGFP转基因载体：首先设计引物制备得到十四烷酰化修饰识别序列(MYR，SEQ ID NO:1)，将双酶切的十四烷酰化修饰识别序列插入到同样酶切的PUAST-EGFP载体中即得到 PUAST-MYR-EGFP转基因载体；

第三步，PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒的构建：将人hEphB4 基因的Kinase domain（即SEQ ID NO:4）克隆进PUAST-MYR-EGFP转基因果蝇载体里，形成PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒；

第四步，将第三步所得显微注射筛选获得即为转基因果蝇。把第三步所得质粒和质粒?2-3混合，通过显微注射仪显微注射到从25℃培养的 y w 果蝇株收集来的果蝇胚胎中。经过培养后，将存活的幼虫挑出放入新鲜食物里。再经过培养后，将羽化出来的雌蝇与一只yw野生型雄蝇杂交放入一管，将羽化出来的雄蝇与一只yw野生型雌蝇杂交，放入一管。所得到的红眼的子代果蝇，即是转基因果蝇，基因型为hEphB4 kinase domain。

所述果蝇模型中的雌性果蝇和雄性果蝇的眼睛均是粗糙的。

所述果蝇模型的眼睛过量表达人的EphB4的激酶结构域，并具有rough eye的表型。

本发明所涉及的筛选EphB4激酶活性抑制剂的果蝇模型，该模型的果蝇眼睛过量表达人的EphB4的激酶结构域，并具有rough eye的表型。

所述果蝇模型中的雄性果蝇的基因型为EphB4 Kinase domain/Y或EphB4 Kinase domain；所述果蝇模型的眼睛是粗糙的；所述的果蝇模型是克隆了人的EphB4的kinase domain 与Src 的7个氨基酸编码区融合到pUAST转基因果蝇载体，然后显微注射筛选所得。

本发明还提供一种筛选EphB4激酶活性抑制剂的方法，其特征在于，是将上述所得果蝇模型中的雌性果蝇和雄性果蝇杂交，得到的子I代果蝇过量表达人EphB4 Kinase domain，眼睛粗糙；在该子I代果蝇发育期的不同阶段，饲喂待筛选药物，筛选出可以使果蝇眼睛由粗糙变为平滑的药物。待筛选的药物参杂在果蝇培养基中。

各步的筛选方法和标准是看翘翅和眼睛的形态。

本发明所构建的果蝇模型一个特点是果蝇眼睛中过量表达人EphB4 Kinase domain，从而导致果蝇的眼睛变得粗糙。特点之二是该果蝇模型表型易于观察，喂药方式简便，药物筛选工作相对快捷，可以快速地进行大量的药物筛选。

一般是将待筛选的药物参杂在果蝇培养基中。具体的喂药方式为将模型果蝇放入无药培养基中，然后将其所产的胚胎转入有药培养基中，观察成体果蝇眼睛的变化，可分为药各类系列和同种药的浓度系列进行比较。

用转基因果蝇模型来筛选药物，有其它系统不可比拟的优势。利用本发明的模型及该方法，使快捷地对大量化合物和中草药进行筛选得以实现，可以据此开发出抑制EphB4激酶活性的药物。

本发明的转基因果蝇模型用于药物筛选，喂食饲料中添加化合物NVP-BHG712（受体酪氨酸激酶(RTK) >> Raf >> Raf 抑制剂，观察果蝇眼部变化，结果眼部肿瘤化得到抑制，眼睛由粗糙变为光滑，说明化合物NVP-BHG712对肿瘤有抑制作用。

附图3中A为野生型果蝇，眼光滑平整；B为EphB4 Kinase domain转基因果蝇，眼肿瘤化；C为EphB4 Kinase domain转基因果蝇喂食饲料中添加化合物NVP-BHG712（受体酪氨酸激酶(RTK) >> Raf >> Raf 抑制剂）后，肿瘤化得到抑制，果蝇眼睛由粗糙变为平滑。充分说明该转基因果蝇模型能很好的用于药物筛选：结果便于观察。

本发明所得的模型可用于按照图4的大致步骤和技术的关键特征进行药物筛选，最终得到药品。

附图说明

图1是PUAST载体图谱；

图2是显微注射筛选获得转基因果蝇的基本流程； 

图3为用果蝇模型快捷筛选EphB4激酶活性抑制剂的结果图。电镜扫描,条件：20KV，X450，50um；

图4为药物筛选的大致步骤和技术的关键特征。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中所用的引物均为invitrogen公司合成，测序也是invitrogen公司。

实施例1：筛选EphB4激酶活性抑制剂的果蝇模型及其构建。

1：PUAST载体改造（PUAST à PUAST-EGFP）

为了能在果蝇蛹期就能检测目的基因是否转进果蝇体内，需要将PUAST (中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心-Biovector Science Lab, Inc.pUAST，载体图谱见图1)载体进行改造，这个载体上面有一段UAS(upstream activating sequence)序列,载体改造的目的是将EGFP连到PUAST载体里，过程如下：

将PUAST载体经XhoI与XbaI双酶切，回收酶切后产物备用；设计EGFP的PCR引物如下：

Xh-EGFP-F：G TAC TCG AGC TTT ATG GTG AGC AAG GGC GAG （SEQ ID NO:7）

X-EGFP-R：AAT CTA GAA CTT GTA CAG CTC GTC CAT G     （SEQ ID NO:8）

用以上这2个引物和pEGFP-N1(中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心-Biovector Science Lab, Inc. pEGFP-N1)为模版PCR，进行EGFP目的片段的扩增。

PCR反应体系如下：

10×PCR buffer：             5 μL

模版pEGFP-N1             1 μL

Xh-EGFP-F                0.8 μL

X-EGFP-R                0.8 μL

dNTP(10mM)：              0.8 μL

Taq酶：                    0.4 μL

ddwater：                   41.2 μL

反应程序：

   ①95℃      5min

                                                  94℃      30s

   57℃      30s

    72℃      40s    -进行30个循环

    72℃      10min

    4℃       保存产物

回收PCR产物，将酶切后的PUAST载体和经回收的PCR产物按1:1的比例加入到1.5mLEppendorff管中，一般一个连接反应使用20-50ng载体或片段,当然我们可以按照实际的连接效果调整加入的载体和片段量，但一般不宜大于150ng。之后往里面加1μL 10×EXOⅢBuffer，用无菌水补至10μL,混匀后冰浴5min，在冰上加1μL EXOⅢ（20U），混匀，冰浴60min。 EXOⅢ酶是核酸外切酶，它在4℃时的酶切速率大约为一小时15bp，所以在加入EXOⅢ酶之前应该确保管中液体的温度已经降至4℃。酶切1小时后，加入1μL0.5M的EDTA（pH8.0）终止酶切反应，将整个体系于60℃中放置5min,使酶进一步变性失活，随后置于冰浴5min,保证载体和插入片段之间稳定结合，之后将1.5mLEppendorff管中所有样品加入到感受态细胞DH₅α中，冰上放置三分钟后涂平板，之后放在培养箱中过夜培养。

第二天从平板上挑取数个单克隆菌落，于2 mL含有AMP抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。将过夜培养物转移至1.5 mL Eppendorf管，8,000 rpm离心30秒。弃上清，加入250 μL STET溶液，震荡重悬菌体沉淀，之后将重悬的菌液在Eppendorf管加热器上100℃加热2分钟，13,000 rpm离心5分钟，用灭菌过的牙签将离心管底部的蛋白沉淀挑出扔弃。加入250 μL异丙醇（isopropanol），立即颠倒混匀后13,000 rpm离心2分钟，弃上清，沉淀倒扣晾干后加入50 μL TE-RNase。所得质粒DNA可用于限制性内切酶XhoI与XbaI酶切分析。酶切鉴定正确的质粒为PUAST-EGFP。

溶液配制：

STET溶液：0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0），5% Triton X-100，0.22 μm滤膜过滤除菌。临用前加入终浓度为1 mg/mL溶菌酶（lysozyme）。

TE-RNase: 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0），10 μg/mL RNase。

提取后的PUAST-EGFP载体放于-20℃冰箱备用。

 2：转基因果蝇载体PUAST-MYR-EGFP的构建（PUAST-EGFPà PUAST-MYR-EGFP）

为了使转进果蝇里的基因能定位在膜上，需要对pUAST-EGFP 载体进行改造，本发明中所用到的克隆和显微注射载体是pUAST-EGFP，将Src病毒的7个氨基酸编码区,也就是十四烷酰化修饰识别序列(MYR)添加进载体里。十四烷酰化修饰识别序列是：ATG GGG AGC AGC AAG AGC AAG（SEQ ID NO:1）。在载体改造中，先将载体用EcoRI、BglII两个酶切位点切开，这两个酶切位点是PUAST载体本身所带的，切开后的载体回收备用；酶切体系：

pUAST-EGFP           1ul(约1ug)

EcoRI                  1ul

BglII                   1ul

10×buffer               5ul

ddw                   42ul

载体回收后备用。

然后设计PUAST-MYR-EGFP的引物，将MYR序列前面加上包括EcoRI酶切位点的载体上的部分片段，MYR后面加上包括BglII酶切位点的载体序列（见下面正向引物F1）。反向引物(见下面反向引物R1)的设计只需要在EGFP终止密码子后设计合适序列并包含XbaI酶切位点，用EcoRI和XbaI两个酶切位点做酶切鉴定最后载体是否改造成功，同时结合扩增片段的条带大小（821bp）鉴定。设计引物：

正向引物F1：ATT GGG AAT TCA TGG GGA GCA GCA AGA GCA AGA TTC GTT AAC AGA TCT（SEQ ID NO:2），其中单下划线代表EcoRⅠ酶切位点；双下划线为BglII酶切位点，加框部分为MYR序列。

反向引物R1：TCTAGAGGATCTTTGTGAAGGA（SEQ ID NO:3），其中单下划线为XbaI酶切位点。

将合成好的引物（invitrogen公司合成）用1×TE溶液稀释成100μM，取10μl稀释好的引物与90μl ddw在1.5ml Eppendorf管里混匀，通过PCR扩增反应得到PCR产物。

反应体系：

10×PCR buffer：             5 μL

模版pUAST-EGFP            1 μL

正向引物F1                0.8 μL

反向引物R1                0.8 μL

dNTP(10mM)：              0.8 μL

Taq酶：                    0.4 μL

ddwater：                   41.2 μL

反应程序：

   ①95℃      5min

   94℃      30s

   56℃      30s

    72℃      1min    -进行30个循环

    72℃      10min

    4℃       保存产物

回收PCR产物，将酶切后的PUAST载体和经回收的PCR产物按1:1的比例加入到1.5mLEppendorff管中，一般一个连接反应使用20-50ng载体或片段,当然我们可以按照实际的连接效果调整加入的载体和片段量，但一般不宜大于150ng。之后往里面加1μL 10×EXOⅢBuffer，用无菌水补至10μL,混匀后冰浴5min，在冰上加1μL EXOⅢ（20U），混匀，冰浴60min。 EXOⅢ酶是核酸外切酶，它在4℃时的酶切速率大约为一小时15bp，所以在加入EXOⅢ酶之前应该确保管中液体的温度已经降至4℃。酶切1小时后，加入1μL0.5M的EDTA（pH8.0）终止酶切反应，将整个体系于60℃中放置5min,使酶进一步变性失活，随后置于冰浴5min,保证载体和插入片段之间稳定结合，之后将1.5mLEppendorff管中所有样品加入到感受态细胞DH₅α中，冰上放置三分钟后涂平板，之后放在培养箱中过夜培养。

第二天从平板上挑取数个单克隆菌落，于2 mL含有AMP抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。将过夜培养物转移至1.5 mL Eppendorf管，8,000 rpm离心30秒。弃上清，加入250 μL STET溶液，震荡重悬菌体沉淀，之后将重悬的菌液在Eppendorf管加热器上100℃加热2分钟，13,000 rpm离心5分钟，用灭菌过的牙签将离心管底部的蛋白沉淀挑出扔弃。加入250 μL异丙醇（isopropanol），立即颠倒混匀后13,000 rpm离心2分钟，弃上清，沉淀倒扣晾干后加入50 μL TE-RNase。所得质粒DNA可用于限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切分析。酶切鉴定正确的质粒为PUAST-MYR-EGFP转基因载体。

 3：PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒的构建

将人hEphB4 基因的Kinase domain（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004444.4，即SEQ ID NO:4）的部分序列克隆进PUAST-MYR-EGFP转基因果蝇载体里，形成PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒，然后显微注射该质粒，筛选获得转基因果蝇。

第一步： PUAST-MYR-EGFP转基因果蝇载体酶切

选择PUAST-MYR-EGFP转基因果蝇载体上BglII和XhoI两个酶切位点，酶切体系：

PUAST-MYR-EGFP         1ul(约1ug)

    XhoI                  1ul

BglII                   1ul

10×buffer               5ul

ddw                   42ul

载体胶回收后备用。

第二步：hEphB4激酶结构域基因的扩增

在hEphB4的激酶结构域（即SEQ ID NO:4）两侧选择合适序列，并考虑激酶结构域的序列设计引物。用这对引物PCR出来的目的片段(966bp)经过回收后，加入到LIC反应体系中，就可与PUAST-MYR-EGFP转基因果蝇载体连接。

hEphB4的PCR正向引物F2：

ATTCGTGAACAGATCTGCCCTAATGAGGCTGTGAG（SEQ ID NO:5），其中单下划线为BglII酶切位点。

hEphB4的PCR反向引物R2：

CAGCCTCACTACTCAGCTGGCTCGAGCTTTATGGTG （SEQ ID NO:6），其中单下划线为XhoI酶切位点。

 将合成好的引物（invitrogen公司合成）用1×TE溶液稀释成100μM，取10μl稀释好的引物与90μl ddw在1.5ml Eppendorf管里混匀。

反应体系：

10×PCR buffer：             5 μL

模版（果蝇的DNA   YW（Bloomington果蝇中心BL#1：Canton-S) ）       1 μL

PCR正向引物F2             0.8 μL

PCR反向引物R2             0.8 μL

dNTP(10mM)：              0.8 μL

Taq酶：                    0.4 μL

ddwater：                   41.2 μL

反应程序：

   ①95℃      5min

   94℃      30s

   56℃      30s

    72℃      1min    -进行30个循环

    72℃      10min

    4℃       保存产物

将PCR反应目的产物胶回收。

第三步：LIC反应由EXOIII DNA 外切酶催化进行。

将酶切后的PUAST-MYR-EGFP转基因果蝇载体和上述第二步PCR所得目的片段按1:1的比例加入到1.5mLEppendorff管中，一般一个连接反应使用20-50ng载体或片段,当然我们可以按照实际的连接效果调整加入的载体和片段量，但一般不宜大于150ng。之后往里面加1μL 10×EXOⅢBuffer，用无菌水补至10μL,混匀后冰浴5min，在冰上加1μL EXOⅢ（20U），混匀，冰浴60min。 EXOⅢ酶是核酸外切酶，它在4℃时的酶切速率大约为一小时15bp，所以在加入EXOⅢ酶之前应该确保管中液体的温度已经降至4℃。酶切1小时后，我们加入1μL0.5M的EDTA（pH8.0）终止酶切反应，将整个体系于60℃中放置5min,使酶进一步变性失活，随后置于冰浴5min,保证载体和插入片段之间稳定结合，之后将1.5mLEppendorff管中所有样品加入到感受态细胞DH₅α中，冰上放置三分钟后涂平板，之后放在培养箱中过夜培养。

第四步：PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒DNA的提取

从平板上挑取数个单克隆菌落，于2 mL含有AMP抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。将过夜培养物转移至1.5 mL Eppendorf管，8,000 rpm离心30秒。弃上清，加入250 μL STET溶液，震荡重悬菌体沉淀，之后将重悬的菌液在Eppendorf管加热器上100℃加热2分钟，13,000 rpm离心5分钟，用灭菌过的牙签将离心管底部的蛋白沉淀挑出扔弃。加入250 μL异丙醇（isopropanol），立即颠倒混匀后13,000 rpm离心2分钟，弃上清，沉淀倒扣晾干后加入50 μL TE-RNase。所得质粒DNA可用于限制性内切酶酶切分析。鉴定正确的PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒放于-20℃冰箱备用

溶液配制：

STET溶液：0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0），5% Triton X-100，0.22 μm滤膜过滤除菌。临用前加入终浓度为1 mg/mL溶菌酶（lysozyme）。

TE-RNase: 10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0），10 μg/mL RNase。

4、转基因果蝇模型的筛选

1）得到上述步骤的PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重组质粒后，经过测序（invitrogen公司），克隆序列完全正确，再从该质粒中提取浓度大于1μg/ul的质料，用ddw溶解。把质粒PUAST-MYR-hEphB4-EGFP和质粒?2-3（Tissue Specificity of Drosophila P Element Transposition Is Regulated at the Level of mRNA Splicing  Cell, Vol. 44, 7-19, January 17, 1986，）混合，终浓度分别为 200 ng/μl 和 50 ng/μl。之后放于4℃保存，最好在一周内注射完。注射之前，将混合液重新离心，在显微注射的过程中，混合液需保存于 4℃。通过显微注射仪显微注射到从25℃培养的 y w 果蝇（Bloomington果蝇中心BL#1：Canton-S）株收集来的果蝇胚胎中。见图2，将盛有果蝇胚胎的盖玻片放在一个培养皿里，培养皿里放一张浸湿的滤纸，再将培养皿放在18度恒温箱里。24小时后，将盖玻片取出，将存活的幼虫挑出放入新鲜食物里。盛有食物的管子放在25度恒温箱里，大约10天后，将羽化出来的雌蝇与一只yw野生型雄蝇（Bloomington果蝇中心BL#1：Canton-S）杂交放入一管，将羽化出来的雄蝇与一只yw野生型雌蝇（Bloomington果蝇中心BL#1：Canton-S）杂交，放入一管。再过大约10天，子代果蝇出来后，在显微镜下镜检，发现红眼果蝇，是转基因果蝇，基因型为hEphB4 kinase domain；

 2）选取所得的雄性hEphB4 kinase domain的转基因果蝇与雌性GMR-Gal4的处女蝇（来自Bloomington果蝇中心BL#9146）杂交得到子I代果蝇（基因型为hEphB4 kinase domain；GMR-Gal4）。得到转基因果蝇模型中的雄性果蝇的方法：挑上述子I代果蝇的的处女蝇与y w/Y;+/Cyo雄蝇（BL#1495：y^[1] w^[1]；BL#4558：FM7a, l(1)TW24[1]/oc[1] ptg[3] l(1)TW1[cs]; CyO/l(2)DTS91[1]，杂交后挑选y w/Y;+/Cyo雄蝇）杂交，后代挑选翘翅rough eye的雄蝇。得到果蝇模型中的雌性果蝇的方法：用得到的果蝇模型中的雄性果蝇与+/FM7;+/Cyo雌性果蝇（BL#1495：y^[1] w^[1]；BL#4558：FM7a, l(1)TW24[1]/oc[1] ptg[3] l(1)TW1[cs]; CyO/l(2)DTS91[1]，杂交后挑选+/FM7;+/Cyo雌性果蝇）杂交，后代挑选bar眼、翘翅、rough eye的雌蝇，得到的雌蝇再与果蝇模型中的雄性果蝇杂交，后代挑选无bar眼、翘翅、rough eye的雌蝇，即转基因果蝇模型中的雌性果蝇。所得到的转基因模型中的雄性和雌性果蝇的基因型为hEphB4 Kinase domain/Y或hEphB4Kinase domain; GMR-Gal4/Cyo。

 实施例2、将转基因果蝇模型用于药物筛选

果蝇模型用于药物筛选的具体步骤是：将上面实施例1得到的hEphB4转基因果蝇模型即眼部发生眼肿瘤化的果蝇喂食饲料中添加化合物NVP-BHG712（受体酪氨酸激酶(RTK) >> Raf >> Raf 抑制剂，美国Selleck公司,网址：http://www.selleck.cn/），观察果蝇眼部变化，结果眼部肿瘤化得到抑制，眼睛由粗糙变为光滑，说明化合物NVP-BHG712对肿瘤有抑制作用。

图3为用果蝇模型快捷筛选hEphB4激酶活性抑制剂的结果图。在图中A为野生型果蝇（来自Bloomington果蝇中心BL#1：Canton-S），眼光滑平整；B为hEphB4 Kinase domain; GMR-Gal4/Cyo转基因果蝇，眼肿瘤化；C为hEphB4 Kinase domain; GMR-Gal4/Cyo转基因果蝇喂食饲料中添加化合物NVP-BHG712（受体酪氨酸激酶(RTK) >> Raf >> Raf 抑制剂，美国Selleck公司,网址：http://www.selleck.cn/）后，肿瘤化得到抑制，果蝇眼睛由粗糙变为平滑。说明该果蝇模型能很好的用于药物筛选：结果便于观察。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  厦门大学海洋三所

 

<120>  一种筛选EphB4激酶活性抑制剂的转基因果蝇模型及其构建方法

 

<130>  P6700

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Src病毒

 

<400>  1

atggggagca gcaagagcaa g                                                 21

 

 

<210>  2

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  2

attgggaatt catggggagc agcaagagca agattcgtta acagatct                    48

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

tctagaggat ctttgtgaag ga                                                22

 

 

<210>  4

<211>  4369

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<400>  4

ttccagcgca gctcagcccc tgcccggccc ggcccgcccg gctccgcgcc gcagtctccc       60

 

tccctcccgc tccgtccccg ctcgggctcc caccatcccc gcccgcgagg agagcactcg      120

 

gcccggcggc gcgagcagag ccactccagg gaggggggga gaccgcgagc ggccggctca      180

 

gcccccgcca cccggggcgg gaccccgagg ccccggaggg accccaactc cagccacgtc      240

 

ttgctgcgcg cccgcccggc gcggccactg ccagcacgct ccgggcccgc cgcccgcgcg      300

 

cgcggcacag acgcggggcc acacttggcg ccgccgcccg gtgccccgca cgctcgcatg      360

 

ggcccgcgct gagggccccg acgaggagtc ccgcgcggag tatcggcgtc cacccgccca      420

 

gggagagtca gacctggggg ggcgagggcc ccccaaactc agttcggatc ctacccgagt      480

 

gaggcggcgc catggagctc cgggtgctgc tctgctgggc ttcgttggcc gcagctttgg      540

 

aagagaccct gctgaacaca aaattggaaa ctgctgatct gaagtgggtg acattccctc      600

 

aggtggacgg gcagtgggag gaactgagcg gcctggatga ggaacagcac agcgtgcgca      660

 

cctacgaagt gtgtgacgtg cagcgtgccc cgggccaggc ccactggctt cgcacaggtt      720

 

gggtcccacg gcggggcgcc gtccacgtgt acgccacgct gcgcttcacc atgctcgagt      780

 

gcctgtccct gcctcgggct gggcgctcct gcaaggagac cttcaccgtc ttctactatg      840

 

agagcgatgc ggacacggcc acggccctca cgccagcctg gatggagaac ccctacatca      900

 

aggtggacac ggtggccgcg gagcatctca cccggaagcg ccctggggcc gaggccaccg      960

 

ggaaggtgaa tgtcaagacg ctgcgtctgg gaccgctcag caaggctggc ttctacctgg     1020

 

ccttccagga ccagggtgcc tgcatggccc tgctatccct gcacctcttc tacaaaaagt     1080

 

gcgcccagct gactgtgaac ctgactcgat tcccggagac tgtgcctcgg gagctggttg     1140

 

tgcccgtggc cggtagctgc gtggtggatg ccgtccccgc ccctggcccc agccccagcc     1200

 

tctactgccg tgaggatggc cagtgggccg aacagccggt cacgggctgc agctgtgctc     1260

 

cggggttcga ggcagctgag gggaacacca agtgccgagc ctgtgcccag ggcaccttca     1320

 

agcccctgtc aggagaaggg tcctgccagc catgcccagc caatagccac tctaacacca     1380

 

ttggatcagc cgtctgccag tgccgcgtcg ggtacttccg ggcacgcaca gacccccggg     1440

 

gtgcaccctg caccacccct ccttcggctc cgcggagcgt ggtttcccgc ctgaacggct     1500

 

cctccctgca cctggaatgg agtgcccccc tggagtctgg tggccgagag gacctcacct     1560

 

acgccctccg ctgccgggag tgccgacccg gaggctcctg tgcgccctgc gggggagacc     1620

 

tgacttttga ccccggcccc cgggacctgg tggagccctg ggtggtggtt cgagggctac     1680

 

gtcctgactt cacctatacc tttgaggtca ctgcattgaa cggggtatcc tccttagcca     1740

 

cggggcccgt cccatttgag cctgtcaatg tcaccactga ccgagaggta cctcctgcag     1800

 

tgtctgacat ccgggtgacg cggtcctcac ccagcagctt gagcctggcc tgggctgttc     1860

 

cccgggcacc cagtggggct gtgctggact acgaggtcaa ataccatgag aagggcgccg     1920

 

agggtcccag cagcgtgcgg ttcctgaaga cgtcagaaaa ccgggcagag ctgcgggggc     1980

 

tgaagcgggg agccagctac ctggtgcagg tacgggcgcg ctctgaggcc ggctacgggc     2040

 

ccttcggcca ggaacatcac agccagaccc aactggatga gagcgagggc tggcgggagc     2100

 

agctggccct gattgcgggc acggcagtcg tgggtgtggt cctggtcctg gtggtcattg     2160

 

tggtcgcagt tctctgcctc aggaagcaga gcaatgggag agaagcagaa tattcggaca     2220

 

aacacggaca gtatctcatc ggacatggta ctaaggtcta catcgacccc ttcacttatg     2280

 

aagaccctaa tgaggctgtg agggaatttg caaaagagat cgatgtctcc tacgtcaaga     2340

 

ttgaagaggt gattggtgca ggtgagtttg gcgaggtgtg ccgggggcgg ctcaaggccc     2400

 

cagggaagaa ggagagctgt gtggcaatca agaccctgaa gggtggctac acggagcggc     2460

 

agcggcgtga gtttctgagc gaggcctcca tcatgggcca gttcgagcac cccaatatca     2520

 

tccgcctgga gggcgtggtc accaacagca tgcccgtcat gattctcaca gagttcatgg     2580

 

agaacggcgc cctggactcc ttcctgcggc taaacgacgg acagttcaca gtcatccagc     2640

 

tcgtgggcat gctgcggggc atcgcctcgg gcatgcggta ccttgccgag atgagctacg     2700

 

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ctgactttgg cctttcccga ttcctggagg agaactcttc cgatcccacc tacacgagct     2820

 

ccctgggagg aaagattccc atccgatgga ctgccccgga ggccattgcc ttccggaagt     2880

 

tcacttccgc cagtgatgcc tggagttacg ggattgtgat gtgggaggtg atgtcatttg     2940

 

gggagaggcc gtactgggac atgagcaatc aggacgtgat caatgccatt gaacaggact     3000

 

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agctggtcag ccagatctct gctgaggacc tgctccgaat cggagtcact ctggcgggac     3360

 

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cccgctggat tgcactttga gcccgtgggg tgaggagttg gcaatttgga gagacaggat     3600

 

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accaccaaac tcaatcattt ttttcccttg taaatgcccc tcccccagct gctgccttca     3960

 

tattgaaggt ttttgagttt tgtttttggt cttaattttt ctccccgttc cctttttgtt     4020

 

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agaaaatggg acgtgtccca gctccagggg taaaaaaaaa aaaaaaaaa                 4369

 

 

<210>  5

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

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<212>  DNA

<213>  人工合成

 

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<212>  DNA

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<212>  DNA

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