铁皮石斛内生细菌特异性巢氏PCR检测方法及所用引物

摘要

本发明公开了一种巢式PCR扩增引物，包括第一次PCR扩增引物（fM1、rC5）和第二次PCR扩增引物（GC夹-f515、rC5）。本发明还同时公开了利用上述引物进行的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR快速检测方法，包括如下步骤：1）、铁皮石斛总基因组DNA的提取；2）、特异性巢氏PCR扩增16S rRNA基因的特定片段：第一次PCR扩增时，退火温度为50-54℃；第二次PCR扩增时，退火温度为55-59℃；3）、DGGE分析：将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳；4）、内生细菌的种属鉴定：选择清晰的DGGE条带，进行PCR扩增；将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对，确定种属特征。

说明书

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法。

背景技术

作为地球上最古老的生物，在38亿年的进化历史长河中，微生物与植 物形成了超级共生体，双方通过基因与信息交流，微生物与植物的进 化、生长繁殖、免疫、抗逆及次生代谢等产生了千丝万缕的联系。作 为植物的“第二基因组”，微生物通过固氮、分泌激素、分解有机物 及促进水分和矿质元素的吸收等多种途径促进植物的生长。内生菌还 能分泌抗生素类物质，或直接产生活性成分而促进药用植物的品质形 成。因此，微生物生态与药用植物的产量和品质密切相关，微生物生 态被认为是药材道地性的重要成因之一。因此，微生物生态检测是衡 量中药材的生长状况和品质控制的重要指标。

目前，微生物生态研究可采用传统分离培养及分子生物学方法。传统 分离培养法由于只能培养1%左右的微生物，因此在微生物生态研究中 往往作为一种辅助方法；基于16S rRNA基因的分子生物学是微生物生 态研究的主要手段。根据“内共生假说”，植物中的叶绿体及线粒体 均由细菌进化而来，叶绿体及线粒体的16S/18S rRNA与细菌16S rR NA具有较高的同源性，因此研究植物内生菌必须设计特异性引物以区 分叶绿体16S rRNA和线粒体18S rRNA基因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏 PCR检测方法及所用引物，本发明解决了现有通用引物无法区分细菌的 16S rRNA与植物叶绿体16S rRNA和线粒体18S rRNA这一难题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种巢式PCR扩增引物，包括第一 次PCR扩增引物和第二次PCR扩增引物，

第一次PCR扩增引物为：

fM1：5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’，

rC5： 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’；

第二次PCR扩增引物为：

GC夹-f515：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGT G CCAGCMGCCGCGGTAA-3’；

rC5： 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。

本发明还同时提供了利用上述巢式PCR扩增引物进行的铁皮石斛内生细 菌的特异性巢氏PCR快速检测方法，包括如下步骤：

1）、铁皮石斛总基因组DNA的提取；

2）、特异性巢氏PCR扩增16S rRNA基因的特定片段：

第一次PCR扩增时，退火温度为50-54℃；

第二次PCR扩增时，退火温度为55-59℃；

3）、DGGE分析；

将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳； 

4）、内生细菌的种属鉴定：

选择清晰的DGGE条带，进行PCR扩增；将扩增片段进行克隆、测序和B LAST比对，确定其种属特征。

作为本发明的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法的改进：

步骤3）为：

DGGE电泳采用6%丙烯酰胺凝胶（60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得）、3 0%-60%的变性剂浓度梯度；打开电泳仪使电泳缓冲液（1×TAE电泳缓 冲液）预热60-120min至温度为55-65℃；加40-60μ1 PCR产物（即， 步骤2）第二次PCR扩增所得），120-180V电泳5-10h后，将DGGE胶在E B溶液（浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液）中染色10-20 min，脱色 15-30min，用凝胶成像系统拍照。

作为本发明的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法的进一步改 进：

步骤4）为：

选择清晰的DGGE条带，割胶回收于1.5ml Eppendorf管中，用无菌研 磨棒研磨，加入50 μ1无菌水，37℃温浴15-30 min，置4℃冰箱12 -16h；1500~2500 rpm离心4~6min，吸取3-5 μ1上清作为模板，用 引物f515和rC5进行PCR扩增，退火温度为54-58℃；将扩增片段进行克 隆、测序和BLAST比对，确定其种属特征；

引物f515：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，

引物rC5：5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。

备注说明：

本发明所涉及的引物中：N=(A/G/C/T)，R=(A/G)，B=(G/C/T)，Y=(C/ T)，H=(A/C/T)；M=(A/C)。

步骤4）中的扩增体系为：l0×Buffer 5μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 1 μ1，2μ1 10 pmol·μ1^-1（f515）、2μ1 10 pmol·μ1^-1（rC5 ），1 μ1 DNA模板，5 U·μ1^-1 Taq 酶0.4 μ1，去离子水38.6  μ1。

本发明的步骤1）铁皮石斛总基因组DNA的提取方法采用改良CTAB法。 具体为：

以铁皮石斛的根或茎作为样品，将样品表面消毒后，液氮研磨至粉末 状，装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中，每管装0.2 g；加入1ml  CTAB提取液（CTAB提取液由以下成分组成：100 mM pH8.0 Tris-H Cl；20 mM pH8.0 EDTA；1.4M NaCl；20mg CTAB--十六烷基三甲 基溴化铵；其余为水），于64~66℃水浴60-90min；离心取上清，加入 苯酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1，共计用量为上清体积的2/3 ），充分混匀，离心取上清，加入氯仿/异戊醇（体积比为24：1，共 计用量为上清体积的2/3）充分混匀，离心取上清，加入1/10 上清体 积的NaAC溶液（浓度为2M~4M）和1个上清体积的无水乙醇，沉淀；离 心弃上清，70%乙醇（体积浓度）洗涤所得沉淀，离心弃上清，真空干 燥；加入50-100 μ1 TE溶液（pH=8.0）溶解DNA。

本发明的步骤2）中：

第一次PCR扩增时：

扩增体系为：l0×Buffer 2.5 μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 0.5 μ1 ，1 μ1 10 pmol·μ1^-1引物（fM1），1 μ1 10 pmol·μ1^-1引 物（rC5），1 μ1 DNA模板（步骤1）所得），5 U· μ1^-1 Taq酶 0.2 μ1 ，去离子水18.8 μ1。

第二次PCR扩增时：

扩增体系为：l0×Buffer 5 μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 1 μ1，2  μ1 10 pmol·μ1^-1引物（GC夹-f515），2 μ1 10 pmol·μ1^-1引物（rC5），1 μ1 DNA模板（第一次PCR扩增所得），5 U·μ1 ^-1 Taq酶0.4μ1，去离子水38.6μ1。

本发明与现有技术相比，检测结果重复性好、操作简便，为铁皮石斛 内生细菌的检测、鉴定及分析优势种群提供了有效方法。

综上所述，本发明基于细菌的16S rRNA与铁皮石斛叶绿体16S rRNA 和线粒体18S rRNA基因序列，设计特异性引物，建立铁皮石斛内生细 菌的巢式PCR检测方法，以期对铁皮石斛内生细菌的多态性及优势种群 进行分析，从而为监控铁皮石斛的生长状况和品质提供依据。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为萧山铁皮石斛根部和茎部的DGGE电泳图谱。

图2为奉化铁皮石斛根部和茎部的DGGE电泳图谱。

图3为庆元铁皮石斛根部和茎部的DGGE电泳图谱。

图4萧山铁皮石斛样品在不同DGGE电泳条件下的图谱。

具体实施方式

实施例1

萧山人工栽培的铁皮石斛植株，采用以下步骤分析该样品根(XSG)和茎 (XSJ)中的内生细菌种群结构：即分别以铁皮石斛的根(XSG)和茎(XSJ )作为样品:

1）铁皮石斛总基因组DNA的提取：采用改良CTAB法，对根部和茎部进 行表面消毒；样品先用流水充分冲洗，从而去掉表面土壤颗粒等杂质 ，然后转移至超净台内用无菌水清洗2次，每次1 min；接着用75%（ V/V）酒精消毒20 sec、3%（质量%）次氯酸钠溶液消毒4 min，无菌 水洗涤3次，用灭过菌的滤纸将表面水分吸干。液氮研磨直至粉末状； 装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中，每管装0.2 g；加入1ml CTA B提取液（CTAB提取液由以下成分组成：100 mM pH8.0 Tris-HCl； 20 mM pH8.0 EDTA；1.4M NaCl；20mg CTAB--十六烷基三甲基溴 化铵；其余为水），于65℃水浴90min；离心（12000 rpm，10 min ）取上清，加入苯酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1，总用量为上 清体积的2/3）；离心（12000 rpm，10 min）取上清，加入氯仿/异 戊醇（体积比为24：1，总用量为上清体积的2/3）；离心（12000 r pm，10 min）取上清，加入1/10 上清体积的3M NaAC溶液和1个上 清体积的无水乙醇，-20℃沉淀30 min；离心（8000 rpm，5 min） 弃上清，用0.5ml 70%（体积浓度）的酒精洗涤所得沉淀两次；离心 （8000 rpm，5min）弃上清，真空干燥（50mb的真空度和25℃的温度 干燥至恒重）；加入50 μ1 TE缓冲溶液（pH=8.0）溶解DNA。

2）特异性巢氏PCR扩增16S rRNA基因的特定片段：

a.特异性巢式PCR以fM1（5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’）和rC5（  5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’）为第一次PCR扩增引物，PCR扩增 的退火温度为54℃。

扩增体系为：l0×Buffer 2.5 μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 0.5 μ1 ，1 μ1 10 pmol·μ1^-1引物（fM1）、1 μ1 10 pmol·μ1^-1引 物（rC5）、1 μ1 DNA模板（步骤1）所得），5 U· μ1^-1 Taq酶 0.2 μ1 ，去离子水18.8 μ1；扩增程序为：94℃预热4 min；9 4℃变性1 min，54℃复性1 min，72℃延伸45s，循环30次；72℃延 伸8 min，8℃保存。

b.采用引物GC夹-f515（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG   GGGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和rC5作为巢式PCR第二次扩增引物 ，退火温度为57℃。扩增体系为：l0×Buffer 5 μ1，10mmol·  μ1^-1 dNTP 1 μ1，2 μ1 10 pmol·μ1^-1引物（f515-GC夹），2  μ1 10 pmol·μ1^-1引物（rC5），1 μ1 DNA模板（上述步骤a 所得），5 U·μ1^-1 Taq酶0.4μ1，去离子水38.6μ1；扩增程序为： 94℃预热4 min；94℃变性1 min，57℃复性1 min，72℃延伸45s， 循环30次；72℃延伸8 min，8℃保存。

3）DGGE分析：将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳。DGGE电泳 采用6%丙烯酰胺凝胶（60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得，该凝胶的用量 共计为40ml）、30%-60%的（30%是指在6%丙烯酰胺凝胶中加入变性剂 直至变性剂的质量浓度为30%，60%是指在6%丙烯酰胺凝胶中加入变性 剂直至变性剂的质量浓度为60%）变性剂浓度梯度；打开电泳仪使 1 ×TAE电泳缓冲液（即Tris-乙酸电泳缓冲液(1×TAE)）预热120min至 温度为60℃；加60μ1 PCR产物，160V电泳7h，DGGE胶在EB溶液（浓 度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液）中染色15min，脱色30min（即进行胶 体背景颜色的处理），凝胶成像系统拍照。

备注说明：

30%-60%的变性剂浓度梯度通过专用的配置DGGE胶的变性胶梯度仪进行 配胶，此为常规技术。变性剂由尿素和去离子甲酰胺按照以下比例配 制而成：尿素（g）/去离子甲酰胺（ml）=12.6g：12ml。

4）内生细菌的种属鉴定：选择清晰的DGGE条带，割胶回收于1.5ml  eppendorf 管中，用无菌研磨棒充分研磨，加入50 μ1 无菌水， 37℃温浴15min，置于4℃冰箱14h；2000 rpm离心5min，吸取5 μ1 上清作为模板，用引物f515（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和rC5 （ 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’）进行PCR扩增，退火温度为56℃ 。

扩增体系为：l0×Buffer 5μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 1μ1，2μ1  10 pmol·μ1^-1（f515）、2μ1 10 pmol·μ1^-1（rC5），1 μ1  DNA模板，5 U·μ1^-1 Taq 酶0.4 μ1，去离子水38.6 μ1；扩增程 序为：94℃预热4 min；94℃变性1 min，56℃复性1 min，72℃延 伸45s，循环30次；72℃延伸8 min，8℃保存。

将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对，确定其种属特征。备注说明 ：上述克隆、测序和BLAST比对可分别依据已经公开发表的AT克隆法、 sanger终止法测序、NCBI网站上进行BLAST比对。

图1中的清晰条带标记为XS1、XS2、XS3、XS4、XSJ1、XSJ2、XSJ3、X SJ4、XSJ5。（备注说明：XS对应的是铁皮石斛的根，XSJ对应的是铁 皮石斛的茎）；结果：

XS1近缘株为Uncultured Xanthomonadaceae bacteriu，登录号为F R668350.1； 

XS2近缘株为Rhodanobacter sp. B64，登录号为EU194895.1；

XS3近缘株为Burkholderia sp. SR-SRT03，登录号为JX885702.1；

XS4近缘株为Burkholderia sp. G12，登录号为JN975201.1；

XSJ1近缘株为Clostridium sp. enrichment culture clone AP -FeEnrich8，登录号为JX828416.1；

XSJ2近缘株为Uncultured bacterium isolate DGGE gel band  B9，登录号为EU680806.1；

XSJ3近缘株为Burkholderia glathei ，登录号为AM392330.1；

XSJ4近缘株为Burkholderia sp. ZBC2，登录号为JQ638272.1；

XSJ5近缘株为Uncultured Burkholderia sp. clone YYSM138，登 录号为EU628909.1 。 

最终可确定：

萧山铁皮石斛根部内生细菌分别属于黄单胞菌科（Xanthomonadaceae ）和伯克氏菌属（Burkholderia）；萧山铁皮石斛茎部内生细菌分别 属于梭菌属（Clostridium）、伯克氏菌属（Burkholderia）和未鉴定 菌株。

实施例1设置了5个重复，结果均一致。

验证实验1：

将实施例1所述的萧山基地人工栽培的铁皮石斛植株，按照目前现有的 高通量测序法对其根和茎进行检测；

所得结果为：结果与实施例1相同。

对比实验1：

将实施例1步骤3）中的电泳时间7h改成5h；其余等同于实施例1。最终 所得的结论为（如图4所示）：DGGE条带不清晰，并且条带明显较少； 导致最终结论的准确性较差。

实施例2

奉化人工栽培的铁皮石斛植株，采用以下步骤分析该样品根(FHG)和茎 (FHJ)中的内生细菌种群结构：即分别以铁皮石斛的根(FHG)和茎(FHJ )作为样品:

1）铁皮石斛总基因组DNA的提取：采用改良CTAB法，对根部和茎部进 行表面消毒；样品先用流水充分冲洗，从而去掉表面土壤颗粒等杂质 ，然后转移至超净台内用无菌水清洗2次，每次1 min；接着用70%（ V/V）酒精消毒20 sec、3%（质量%）次氯酸钠溶液消毒4 min，无菌 水洗涤3次，用灭过菌的滤纸将表面水分吸干。液氮研磨直至粉末状； 装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中，每管装0.2 g；加入1ml CTA B提取液于65℃水浴60 min；离心（12000 rpm，10 min）取上清， 加入苯酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1，总用量为上清体积的2 /3）； 离心（12000 rpm，10 min）取上清，加入氯仿/异戊醇（体积比为 24：1，总用量为上清体积的2/3）；离心（12000 rpm，10 min）取 上清，加入1/10 上清体积的3M NaAC溶液和1个上清体积的无水乙醇 ，-20℃沉淀30 min；离心（8000 rpm，5 min）弃上清，用0.5ml  70%（体积浓度）的酒精洗涤所得沉淀两次；离心（8000 rpm，5m in）弃上清，真空干燥（50mb的真空度和25℃的温度干燥至恒重）； 加入50 μ1 TE缓冲溶液（pH=8.0）溶解DNA。

 2）特异性巢氏PCR扩增16S rRNA基因的特定片段：

a.特异性巢式PCR以fM1（5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’）和rC5（  5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’）为第一次PCR扩增引物，PCR扩增 的退火温度为54℃。

扩增体系为：l0×Buffer 2.5 μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 0.5 μ1 ，1 μ1 10 pmol·μ1^-1引物（fM1），1 μ1 10 pmol·μ1^-1引 物（rC5），1 μ1 DNA模板（步骤1）所得），5 U· μ1^-1 Taq酶 0.2 μ1 ，去离子水18.8 μ1；扩增程序为：94℃预热4 min；9 4℃变性1 min，54℃复性1 min，72℃延伸45s，循环30次；72℃延 伸8 min，8℃保存。   

b.采用引物GC夹-f515（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG  GGGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和rC5作为巢式PCR第二次扩增引 物，退火温度为57℃。

扩增体系为：l0×Buffer 5 μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 1 μ1，2  μ1 10 pmol·μ1^-1引物（f515-GC夹），2 μ1 10 pmol·μ1^-1引物（rC5），1 μ1 DNA模板（步骤a所得），5 U·μ1^-1 Taq酶0. 4μ1，去离子水38.6μ1；扩增程序为：94℃预热4 min；94℃变性1  min，57℃复性1 min，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸8 min ，8℃保存。

3）DGGE分析：将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳。DGGE电泳 采用6%丙烯酰胺凝胶（60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得，该凝胶的用量 共计为40ml）、30%-60%的变性剂浓度梯度；打开电泳仪使 1×TAE电 泳缓冲液预热120min至温度为60℃；加60μ1 PCR产物，120V电泳10 h，DGGE胶在EB溶液（质量浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液）中染色 15min，脱色20min（即进行胶体背景颜色的处理），凝胶成像系统拍 照。

4）内生细菌的种属鉴定：选择清晰的DGGE条带，割胶回收于1.5ml  eppendorf 管中，用无菌研磨棒充分研磨，加入50 μ1 无菌水， 37℃温浴15min，置于4℃冰箱16h；2000 rpm离心5min，吸取5 μ1 上清作为模板，用引物f515（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和rC5 （ 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’）进行PCR扩增，退火温度为56℃ 。

扩增体系为：l0×Buffer 5μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 1μ1，2μ1  10 pmol·μ1^-1（f515），2μ1 10  pmol·μ1^-1（rC5），1 μ1 DNA模板，5 U·μ1^-1 Taq 酶0.4 μ 1，去离子水38.6 μ1；扩增程序为：94℃预热4 min；94℃变性1  min，56℃复性1 min，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸8 min， 8℃保存。

将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对，确定其种属特征。备注说明 ：上述克隆、测序和BLAST比对可分别依据已经公开发表的AT克隆法、 sanger终止法测序、NCBI网站上进行BLAST比对。

图2中的清晰条带标记为FH1、FH2、FH3、FH4、FHJ1、FHJ2、FHJ3、F HJ4、FHJ5。结果：

FH1近缘株为Uncultured Bordetella sp. clone 34，登录号为E U723426.1；

FH2近缘株为Uncultured bacterium clone nbw502a12c1，登录号 为GQ101982.1；

FH3近缘株为Gamma proteobacterium SCGC AAA044-D14，登录号为 HQ663449.1；

FH4近缘株clone TA_95，登录号为JQ048310.1；

FHJ1近源株为Uncultured Moraxellaceae bacterium clone TA_ 95（近源株登录号为JQ048310.1），FHJ1在NCBI上的登录号为KC4652 05；

FHJ2近缘株为Pseudomonas sp. PK-3，登录号为EU685822.1；

FHJ3近缘株为Burkholderia tropica strain E276b，登录号为JN 695890.1；

FHJ4近缘株为Uncultured bacterium，登录号为HF544749.1；

FHJ5近缘株为Uncultured organism clone，登录号为HQ755085.1。

最终可确定：

奉化铁皮石斛根部内生细菌分别属于鲍特杆菌属（Bordetella）、沙 雷氏菌属（Serratia）和未鉴定菌株；奉化铁皮石斛茎部内生细菌分 别属于假单胞菌目（Pseudomonadales）和伯克氏菌属（Burkholderi a）。

实施例2设置了5个重复，结果均一致。

验证实验2：

将实施例2所述的奉化人工栽培的铁皮石斛植株，按照目前现有的高通 量测序法对其根和茎进行检测；

所得结果为：结果与实施例2相同。

实施例3

庆元人工栽培的铁皮石斛植株，采用以下步骤分析该样品根(QYG)和茎 (QYJ)中的内生细菌种群结构：即分别以铁皮石斛的根(QYG)和茎(QYJ )作为样品:

1）铁皮石斛总基因组DNA的提取：采用改良CTAB法，对根部和茎部进 行表面消毒；样品先用流水充分冲洗，去掉表面土壤颗粒等杂质后， 转移至超净台内用无菌水清洗2次，每次1 min；接着用75%（V/V）酒 精消毒20 sec、3%（质量%）次氯酸钠溶液消毒4 min，无菌水洗涤 3次，用灭过菌的滤纸将表面水分吸干。液氮研磨直至粉末状；装入1 .5 ml 无菌的eppendorf管中，每管装0.2 g；加入1ml CTAB提取 液于65℃水浴70min；离心（12000 rpm，10 min）取上清，加入苯 酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1，总用量为上清体积的2/3）； 离心（12000 rpm，10 min）取上清，加入氯仿/异戊醇（体积比为 24：1，总用量为上清体积的2/3）；离心（12000 rpm，10 min）取 上清，加入1/10 上清体积的3M NaAC溶液和1个上清体积的无水乙醇 ，-20℃沉淀45 min；离心（8000 rpm，5 min）弃上清，用0.5ml  70%（体积浓度）的酒精洗涤所得沉淀两次；离心（8000 rpm，5m in）弃上清，真空干燥（50mb的真空度和25℃的温度干燥至恒重）； 加入50 μ1 TE缓冲溶液（pH=8.0）溶解DNA。

2）特异性巢氏PCR扩增16S rRNA基因的特定片段：

a.特异性巢式PCR以fM1（5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’）和rC5（  5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’）为第一次PCR扩增引物，PCR扩增 的退火温度为54℃。

扩增体系为：l0×Buffer 2.5 μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 0.5 μ1 ，1 μ1 10 pmol·μ1^-1引物（fM1），1 μ1 10 pmol·μ1^-1引 物（rC5），1 μ1 DNA模板，5 U· μ1^-1 Taq酶0.2 μ1 ，去离 子水18.8 μ1；扩增程序为：94℃预热4 min；94℃变性1 min，5 4℃复性1 min，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸8 min，8℃保存 。 

b.采用引物GC夹-f515（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACG  GGGGGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和rC5作为巢式PCR第二次扩增引 物，退火温度为57℃。

扩增体系为：l0×Buffer 5 μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 1 μ1，2  μ1 10 pmol·μ1^-1引物（f515-GC夹），2 μ1 10 pmol·μ1^-1引物（rC5），1 μ1 DNA模板，5 U·μ1^-1 Taq酶0.4μ1，去离子水 38.6μ1；扩增程序为：94℃预热4 min；94℃变性1 min，57℃复性 1 min，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸8 min，8℃保存。

3）DGGE分析：将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳。DGGE电泳 采用6%丙烯酰胺凝胶（60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得，该凝胶的用量 共计为40ml）、30%-60%的变性剂浓度梯度；打开电泳仪使 1×TAE电 泳缓冲液预热120min至温度为60℃；加60μ1 PCR产物，160V电泳7h ，DGGE胶在EB溶液（质量浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭溶液）中染色 15min，脱色30min（即进行胶体背景颜色的处理），凝胶成像系统拍 照。

4）内生细菌的种属鉴定：选择清晰的DGGE条带，割胶回收于1.5ml  eppendorf 管中，用无菌研磨棒充分研磨，加入50 μ1 无菌水， 37℃温浴15min，置于4℃冰箱14h；2000 rpm离心5min，吸取5 μ1 上清作为模板，用引物f515（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和rC5 （ 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’）进行PCR扩增，退火温度为56℃ 。

扩增体系为：l0×Buffer 5μ1，10mmol·μ1^-1 dNTP 1μ1，2μ1  10 pmol·μ1^-1（f515），2μ1 10 pmol·μ1^-1（rC5），1 μ1  DNA模板，5 U·μ1^-1 Taq 酶0.4 μ1，去离子水38.6 μ1；扩增程 序为：94℃预热4 min；94℃变性1 min，56℃复性1 min，72℃延 伸45s，循环30次；72℃延伸8 min，8℃保存。

将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对，确定其种属特征。备注说明 ：上述克隆、测序和BLAST比对可分别依据已经公开发表的AT克隆法、 sanger终止法测序、NCBI网站上进行BLAST比对。

图3中的清晰条带标记为QY1、QY2、QY3、QY4、QY5、QYJ1、QYJ2、QY J3、QYJ4、QYJ5、QYJ6、 QYJ7。

结果：

QY1近缘株为Sphingomonas sp. N67，登录号为HM241216.1；

QY2近缘株为Pseudomonas sp. enrichment culture clone C2( 2012)，登录号为JX965944.1；

QY3近缘株为Uncultured bacterium clone TNOr1w05Fastd2_1886 3，登录号为JQ372059.2；

QY4近缘株为Burkholderia sp. S43，登录号为JX293318.1；

QY5近缘株为Uncultured Burkholderia sp. clone Bi4E12，登录 号为JQ994113.1；

QYJ1近缘株为Uncultured bacterium，登录号为HF544749.1；

QYJ2近缘株为Uncultured gamma proteobacterium clone AAA17 4_E22，登录号为JN839756.1；

QYJ3近缘株为Novosphingobium rosa，登录号为AB680810.1；

QYJ4近缘株为Pseudomonas sp. B22(2012b)，登录号为JN975132.1 ；

QYJ5近缘株为Novosphingobium sp. Lig18，登录号为JQ917960.1；

QYJ6近缘株为Burkholderia sp. G1-11，登录号为KC153262.1；

QYJ7近缘株为Sphingomonas sp.，登录号为AB076396.1。

最终可确定：

庆元铁皮石斛根部内生细菌分别属于鞘脂单胞菌属（Sphingomonas） 、伯克氏菌属 （Burkholderia）和未鉴定菌株；庆元铁皮石斛茎部内生细菌分别属 于假单胞菌目（Pseudomonadales）、伯克氏菌属（Burkholderia）、 新鞘脂菌属（Novosphingobium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas） 和未鉴定菌株。

实施例3设置了5个重复，结果均一致。

验证实验3：

将实施例3所述的庆元人工栽培的铁皮石斛植株，按照目前现有的高通 量测序法对其根和茎进行检测；

所得结果为：结果与实施例3相同。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例 。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普 通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均 应认为是本发明的保护范围。