红景天提取物中主要成分的含量测定方法

摘要

本发明涉及一种红景天提取物中没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸含量测定方法，包括：分别制备没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液、酪醇对照品溶液、对香豆酸对照品溶液和制备红景天提取物供试品溶液；以Phenomenex Luna C

说明书

技术领域

本发明涉及中药药材的检测领域，具体涉及中药药材红景天的检测方法。

背景技术

大花红景天为景天科红景天属Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba 植物的干燥根和根茎，为2010年版中国药典明确规定的仅此一种景天属植物的 药用资源。我国为大花红景天的分布中心，储存量大，植物中含有红景天苷、 酪醇、大花红天素、多酚类及多糖类等。现代药理研究表明红景天具有抗衰老、 抗氧化性溶血、抗辐射等活性。近年来的“红景天热”使得红景天提取物被广 泛应用，其质量是保证药效的前提，有较多文献报道用高效液相法测定红景天 药材中有效成分：

目前有关红景天提取物质量评价的报道较少，大花红景天的质量控制仅以 红景天苷的含量为指标，这可能是由于市场上红景天植物来源复杂，各地习用 品种也有所不同，且不同来源的红景天成分差异较大，这些评价方法存在一定 的缺陷。建立高效、准确且适用性广的检测和评价方法，为大花红景天提取物 质量评价提供依据为当前需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供红景天提取物中主要成分的含量测定方法，所述测定 方法利用高效液相色谱(HPLC)，在双波长下对红景天提取物中没食子酸、红 景天苷、酪醇及对香豆酸含量的进行测定，可同时检测红景天提取物中没食子 酸、红景天苷、酪醇及对香豆酸含量，所述检测方法具有高效、准确且适用性 广等有益效果，可为红景天提取物的质量评价提供依据。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种红景天提取物中主要成分的含量测定方法，其特征在于，包括下述步 骤：

1)以乙醇作为溶剂，从红景天中制备红景天提取物；

2)分别制备没食子酸对照品溶液、红景天苷对照品溶液、酪醇对照品溶液 和对香豆酸对照品溶液以及红景天提取物供试品溶液；

3)利用高效液相色谱分析法在双波长同时检测红景天提取物中没食子酸、 红景天苷、酪醇和对香豆酸含量；

色谱条件为：HPLC色谱柱为Phenomenex Luna C18柱，流动相为乙腈(A) -0.1～0.5％冰醋酸溶液(B)，洗脱程序为：0→5min，A从0线性上升至6～12％， B从100％线性下降至94～88％；5→30min，A从6～12％线性上升至20～30％，B 从94～88％线性下降至80～70％；30→35min，A从20～30％线性上升至35～45％， B从80～70％线性下降至65～55％；柱温：20～40℃；体积流量0.5～1.5mL·min^-1； 检测波长：275nm、308nm；进样量2～20μl；

4)根据高效液相色谱分析结果计算红景天提取物中没食子酸、红景天苷、 酪醇和对香豆酸的含量。

进一步地，上述的含量测定方法，以15～30％乙醇为溶剂制备红景天提取物， 优选以20％乙醇为溶剂制备红景天提取物。

进一步地，上述的含量测定方法的色谱条件为：

HPLC色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为 乙腈(A)-0.3％冰醋酸溶液(B)，洗脱程序为：0～5min，9％A；5～30min，9％～25％A， 30～35min，25％～40％A；柱温：40℃；体积流量0.7mL·min-1；检测波长：275nm、 308nm；进样量10μl。

进一步地，上述的含量测定方法，从红景天中制备红景天提取物包括以下 步骤：

1)取红景天药材用6～8倍量的水煎煮1～3h，过滤，得第一次滤液和滤渣， 滤渣再加6～10倍量的水煎煮1～3h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液并减压 浓缩至滤液的1/20～1/12体积，获得浓缩液I；

2)用大孔树脂对浓缩液I进行纯化，以红景天药材与树脂的重量比1∶2进 行上样；然后先以水洗脱，弃去水液，再以15～30％乙醇洗脱，收集15～30％乙 醇洗脱液；

3)将洗脱液浓缩至密度1.05～1.10，得浓缩液II；

4)用80％乙醇醇沉浓缩液II24～36h，得上清液，弃沉淀；

5)将醇沉上清液浓缩、干燥、粉碎，获得红景天提取物。

进一步地，上述从红景天中制备红景天提取物包括以下步骤：

1)取红景天药材用8倍量的水煎煮2h，过滤，得第一次滤液和滤渣，滤渣 再加8倍量的水煎煮2h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液并减压浓缩至滤 液的1/16积，获得浓缩液I；

2)用大孔树脂对浓缩液I进行纯化，以红景天药材与树脂的重量比1∶2进 行上样；然后先以水洗脱，弃去水液，再以20％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱 液；

3)将洗脱液浓缩至密度1.05～1.10，得浓缩液II；

4)用80％乙醇醇沉浓缩液II24～32h，得上清液，弃沉淀；

5)将醇沉上清液浓缩、干燥、粉碎，获得红景天提取物。

进一步地，红景天药材是红景天或大株红景天。

已知红景天含有红景天苷、酪醇、焦硫酸、没食子酸、β-谷甾醇、黄酮类 及香豆素类成分。本发明将红景天进行提取纯化以后，其中各种成分，特别是 香豆酸在色谱中清晰可辨，而且峰面积较大，可将香豆酸含量引入到质量控制。 采用本发明的含量测定方法对红景天提取物中具代表性的四个成分进行测定， 使红景天提取物的成分更加明确、质量控制更加严格，为红景天提取物的质量 控制提供数据。

本发明所述的含量测定方法，利用高效液相色谱(HPLC)，分别在275nm 和308nm双波长下一次性对红景天提取物中没食子酸、红景天苷、酪醇及对香 豆酸含量的进行测定，只需制备一次供试品、检测一次便可完成上述四种成分 的检测工作。

本发明的检测方法具有以下有益效果：

1、现有技术还没有对红景天提取物主要成份含量进行测定的方法，本发明 提供了同时对红景天提取物中没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸含量的含 量测定的方法；

2、本发明首次提供了利用双波长法同时测定红景天提取物中的红景天苷、 没食子酸、酪醇和对香豆酸四种成分的方法；尤其是在308nm处检测红景天提 取物中对香豆酸成分的方法；

3、本发明提供的方法，采用的是Phenomenex Luna C18柱，与现有技术报 道的小粒径HALO C18柱、Kromasil C18柱、Thermo C18柱、YWG-C18柱相比， 能够实现在相对较短的时间内分离成分且分离度好的效果；

4、本申请提供的含量测定技术，与现有技术相比，减少了实验次数，实验 操作简便，实验条件简单可控，同时具有高效、准确、适用性广的特点。

附图说明

图1是流动相从上到下依次为乙腈-0.3％冰醋酸、乙腈-水、甲醇-冰醋酸、 乙腈-0.1％磷酸，柱温30℃、流速为1ml/min，色谱柱为Phenomenex Luna C₁₈柱 的色谱图。

图2是流动相为乙腈-0.3％冰醋酸、色谱柱为Phenomenex Luna C₁₈柱、流速 为1ml/min，从上到下柱温依次为25℃、30℃、40℃的色谱图。

图3是流动相为乙腈-0.3％冰醋酸、色谱柱为Phenomenex Luna C₁₈柱、柱温 为40℃、流速从上到下依次为0.5、0.7、1.0、1.5ml/min的色谱图。

图4是没食子酸、红景天苷、酪醇对照品溶液的色谱图；其中图4A中从左 到右ΔΔ分别标示没食子酸、红景天苷、酪醇在275nm处的最大吸收峰；图4B 表示在200-400nm全波长紫外吸收色谱图，从上到下分别为没食子酸、红景天 苷、酪醇。

图5是对香豆酸对照品溶液的色谱图，其中图5A表示在308nm处的对香 豆酸的液相图谱，ΔΔ表示最大吸收峰；图5B表示对香豆酸200-400nm全波长 紫外吸收图。

图6是提取溶剂依次为甲醇、乙醇、80％甲醇、80％乙醇、20％乙醇的色谱 图。

图7是从上到下的色谱柱依次为Kromasil C₁₈柱、Thermo C₁₈柱、 Phenomenex Luna C18柱、HALO C18柱、InertsilODS2SP柱、YWG-C18柱的 色谱图。

其中，流动相为乙腈-0.3％冰醋酸、柱温：40℃；体积流量1.0mL·min-1； 检测波长：275nm。

图8是没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸的混合对照品以及红景天提 取物100702批的色谱图；

其中，A1是波长为275nm的混合对照品色谱图；A2是波长为275nm的红 景天提取物色谱图；B1是波长为308nm的混合对照品色谱图；B2是波长为 308nm的红景天提取物色谱图；1是没食子酸；2是红景天苷；3是酪醇；4 是对香豆酸。

图9是红景天提取物100902批的含量测定色谱图。

图10是红景天提取物101001批的含量测定色谱图。

具体实施方式

以下实施例中使用的仪器与试药：

高效液相色谱仪(Waters2695-2487美国)；BP-211D电子天平(Sartorius德 国)；色谱柱Phenomenex Luna C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；离心机Centrifuge 5415D。

红景天提取物(江苏康缘药业股份有限公司)，其提取方法见实施例1。

没食子酸对照品(批号110831-200803)；红景天苷对照品(批号 110818-200404)；酪醇(批号111676-200602)；以上对照品均购自中国药品生物 制品检定所。

对香豆酸购自成都曼斯特生物科技有限公司、批号MUST-11122604。

乙腈(色谱纯上海星可生化有限公司)，水为去离子水，其余均为分析纯。

【实施例1】红景天提取物的制备

取西藏产红景天(红景天含量≥1.0％)药材10kg，用8倍重量的水煎煮2h 后取第一次滤液；滤渣再加8倍重量的水煎煮2h，取第二次滤液，合并两次滤 液并减压浓缩至10L，获得浓缩液I。用大孔树脂对浓缩液I进行纯化，上样比 例为1g红景天药材：2g树脂；然后先以水洗脱，弃去水液，再以20％乙醇洗脱， 收集20％乙醇洗脱液。将洗脱液浓缩至密度1.05-1.10，得浓缩液II。然后将浓 缩液II用80％乙醇醇沉24-32小时，得上清液，弃沉淀。将醇沉上清液浓缩、 干燥、粉碎，获得红景天提取物。

【实施例2】筛选红景天提取物中没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸含量的 检测条件。

红景天提取物的制备：按实施例1所述的方法制得，批号为100702。

色谱条件的筛选

考察了乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.3％冰醋酸、甲醇-水、甲醇-0.1％ 磷酸等流动相系统，结果如图1所示，经试验比较，最终确定以乙腈-0.3％冰醋 酸梯度洗脱完成以上四个成分的含量测定。

考察了25℃、30℃、40℃不同柱温，结果如图2所示；以及0.5、0.7、1.0、 1.5mL/min不同流速对各成分分离的影响，结果如图3所示；发现在40℃、流 速为0.7mL/min时分离效果最佳。

全波长扫描的筛选

对没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸对照品溶液全波长扫描(200～400nm) 发现除香豆酸外其它三个成分均在275nm附近有最大吸收，但在220nm处测定 基线波动较大，故选择275nm作为没食子酸、红景天苷、酪醇的检测波长，如 图4所示；对香豆酸最大吸收值308nm作为其测定波长，如图5所示。

提取溶剂筛选

考察了不同浓度的甲醇、乙醇，结果如图6所示，其中乙醇、80％乙醇提取 色谱图峰形不好，不计算含量，以下为甲醇、80％甲醇、20％乙醇提取含量比较， 结果为20％乙醇最佳。

色谱柱的选择

依次考察了Kromasil C₁₈柱、Thermo C₁₈柱、Phenomenex Luna C₁₈柱、HALO  C18柱，InertsilODS2SP柱、YWG-C18柱，结果如图7所示，Phenomenex Luna  C₁₈柱分离效果最佳。

【实施例3】红景天提取物中没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸的含量检测 色谱条件和系统适应性：

色谱柱为Phenomenex Luna C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈(A) -0.3％冰醋酸溶液(B)，洗脱程序为：0～5min，9％A；5～30min，9％～25％A， 30～35min，25％～40％A；柱温：40℃；体积流量0.7mL·min^-1；检测波长：275nm、 308nm；进样量10μl。取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，样品中各待 测组分与相邻峰的分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，塔板数按红 景天苷计算大于20000。色谱图如图8所示。

对照品溶液制备

分别取没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸对照品适量，精密称定，用 甲醇溶解并稀释成浓度分别为391.2μg·mL^-1、1460.0μg·mL^-1、1000.8μg·mL^-1、 517.6μg·mL^-1的对照品储备溶液。

供试品溶液制备

称取红景天提取物约50mg，精密称定，置25mL量瓶内，加入20％乙醇溶 解并定容，摇匀，即得。

线性关系试验

精密量取没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸对照品储备溶液适量于10mL 容量瓶内，用甲醇稀释定容，摇匀，即得混合对照品溶液，再将混合对照品溶 液用甲醇倍倍稀释，定容，即得标准曲线所需的六个浓度的混合对照品溶液， 摇匀离心，取离心液，按上述色谱条件和系统适应性项下色谱条件进样测定， 记录色谱图，以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标进行线性回归，结果表明， 各成分在相应浓度范围内呈良好线性关系，线性范围、回归方程、相关系数见 表1。

表1线性范围、回归方程和相关系数

仪器精密度试验

吸取对照品混合溶液(没食子酸浓度为3.478μg·mL^-1，红景天苷浓度为 182.500μg·mL^-1，酪醇为62.550μg·mL^-1，对香豆酸为12.940μg·mL^-1)，按上述色 谱条件和系统适应性项下色谱条件进样测定，重复进样6次，测得峰面积，计 算RSD。没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸的峰面积的RSD分别为：0.90％， 0.89％，1.00％，1.10％，表明仪器精密度良好。

重复性

取红景天提取物(批号100702)按上述供试品溶液制备项下方法平行制备 供试品溶液六份，按上述色谱条件和系统适应性项下色谱条件进样测定，记录 色谱图，计算没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸含量的RSD分别为2.43％， 2.19％，2.78％，2.84％。

结果表明本方法重复性良好。

稳定性

取红景天提取物供试品溶液(批号100702)，在室温条件下分别于0、3、6、 9、12、15、18h按上述色谱条件和系统适应性项下色谱条件进样测定，记录色 谱图，计算没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸含量的RSD分别为2.10％， 2..46％，1.78％和2.52％。

结果表明，供试品溶液在18小时内稳定。

回收率试验

取红景天提取物样品(批号100702)共6份，每份约20mg，精密称定，置 25mL量瓶内，分别加入没食子酸，酪醇、对香豆酸对照品储备溶液适量，再精 密称定红景天苷对照品6份，分别加入样品中，用20％乙醇溶解后定容，按上 述色谱条件和系统适应性项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算没食子酸、 红景天苷、酪醇、对香豆酸的加样回收率，结果见表2。

表2回收率测定(n＝6)

样品测定

取红景天提取物(批号100702)按上述供试品溶液制备项下方法制备供试 品溶液，按上述色谱条件和系统适应性项下色谱条件，进样测定，记录色谱图， 计算没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸的百分含量，结果见表3。

表3红景天提取物100702批含量测定

【实施例4】红景天提取物中没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸的含量检测 红景天提取物的制备：按实施例1所述的方法制得，批号为100902。

色谱条件和系统适应性：

色谱柱为Phenomenex Luna C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈(A) -0.5％冰醋酸溶液(B)，洗脱程序为：0～5min，6％A；5～30min，6％～20％A， 30～35min，20％～35％A；柱温：20℃；体积流量0.5mL·min^-1；检测波长：275nm、 308nm；进样量5μl。

对照品溶液制备

分别取没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸对照品适量，精密称定，用 甲醇溶解并稀释成浓度分别为391.2μg·mL^-1、1460.0μg·mL^-1、1000.8μg·mL^-1、 517.6μg·mL^-1的对照品储备溶液。

供试品溶液制备

称取红景天提取物约50mg，精密称定，置25mL量瓶内，加入15％乙醇溶 解并定容，摇匀，即得。

样品测定

取红景天提取物(批号100902)按上述供试品溶液制备项下方法制备供试 品溶液，按上述色谱条件和系统适应性项下色谱条件，进样测定，记录色谱图， 计算没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸的百分含量，结果见表4，色谱图如 图9所示。

表4红景天提取物100902批含量测定

【实施例5】红景天提取物中没食子酸、红景天苷、酪醇和对香豆酸的含量检测 红景天提取物的制备：按实施例1所述的方法制得，批号为101001。

色谱条件和系统适应性：

色谱柱为Phenomenex Luna C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈(A) -0.1％冰醋酸溶液(B)，洗脱程序为：0～5min，12％A；5～30min，12％～30％A， 30～35min，30％～45％A；柱温：30℃；体积流量1.4mL·min^-1；检测波长：275nm、 308nm；进样量20μl。

对照品溶液制备

分别取没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸对照品适量，精密称定，用 甲醇溶解并稀释成浓度分别为391.2μg·mL^-1、1460.0μg·mL^-1、1000.8μg·mL^-1、 517.6μg·mL^-1的对照品储备溶液。

供试品溶液制备

称取红景天提取物约50mg，精密称定，置25mL量瓶内，加入30％乙醇溶 解并定容，摇匀，即得。

样品测定

取红景天提取物(批号101001)按上述供试品溶液制备项下方法制备供试 品溶液，按上述色谱条件和系统适应性项下色谱条件，进样测定，记录色谱图， 计算没食子酸、红景天苷、酪醇、对香豆酸的百分含量，结果见表5，所示色谱 图如图10所示。

表5红景天提取物101001批含量测定