蕲山药试管零余子快速繁殖方法

摘要

一种蕲山药试管零余子快速繁殖方法，以通过茎尖组织培养获得的蕲山药脱毒试管苗为外植体，以改良的MS为培养基，该培养基中NH

说明书

技术领域

本发明涉及一种蕲山药试管零余子的快速繁殖方法，旨在通过植物组织培养技术实现蕲山药零余子的规模化生产。属于生物工程和农业生物技术领域。 

技术背景

医圣李时珍故里湖北省蕲春县山药种植历史悠久，蕲山药（Dioscoreae Oppositae“Qi”）是以蕲春县为原产地的鄂东地区大面积种植的山药优良地方种，为《本草纲目》所推崇。仅在蕲春县蕲山药的常年种植面积就超过2000hm²，年产山药逾7×10⁴t，已经成为当地政府重点扶持的农业特色支柱产业，2012年申报了中国地理标志产品保护。 

目前，蕲山药主要采用无性繁殖方式进行繁育，所用的营养器官有栽子、块茎和零余子。各种营养器官繁育蕲山药的优势和缺点都十分明显，例如，用栽子繁育可以直接栽种，出苗整齐，长势旺，山药产量高、卖相好，但工作量大、成本高，不适合大面积生产，且连续栽种3～4年后，顶芽退化严重，产量大幅下降；用块茎切段繁育连续栽种不易退化，有利于种性的保持，但用种量大，块茎分割费工费时，成本高，且出芽时间长，早春遇上阴雨天然气，烂种、死苗时有发生，影响产量和品质；用零余子繁育能够大量节省种薯，省时省工，但生产周期较长，且连续多年播种零余子后种质出现严重退化。因此，寻找一种合理的繁育方式一直是蕲山药生产上的一道难题。2010年以来，申请人采用组织培养技术繁育蕲山药，在较短时间内获得了大量的蕲山药种苗，并申请了国家发明专利“蕲山药组培育苗方法”（专利申请号:201110451511.1）。虽然采用组织培养技术繁育蕲山药种苗，不仅可以获得优良性状的单株，而且可以改善品质，保持蕲山药种的纯度，但由于受技术条件的限制和传统用种习惯的影响，目前无法在农户中大面积推广。 

生产实践中，农户通常采用块茎和零余子交替繁育，以维持蕲山药的种性不被退化。零余子是山药的叶腋处长出的珠芽（俗称为气生块茎），大田条件下一般在山药收获期采摘零余子。由于零余子的形成影响地下块茎的产量，为了提高产量和保证山药的品质，农户习惯于用“疏芽”的方式去掉零余子，使得零余子的数量和品质都不能满足生产上的需要，以致影响块茎与零余子交替繁育的保种效果。由于在现有技术中还没有解决蕲山药零余子的人工诱导条件和试管零余子的生产等问题，因此，借助植物组织培养技术规模化生产蕲山药零余子，对于解决蕲山药生产上零余子的实际需求具有重要的现实意义。 

发明内容

本发明的目的是建立一种蕲山药试管零余子的快速繁殖方法，实现人工规模化生产蕲山药零余子，缩短生产周期，降低生产成本，提高生产效率。 

实现本发明的技术方案为： 

一种蕲山药试管零余子的繁殖方法，以通过茎尖组织培养获得的蕲山药脱毒试管苗为外植体，以改良的MS培养基为培养基，该培养基中NH₄NO₃含量为MS培养基的1/4～3/4，同时添加BA（细胞分裂素）1.0mg/L、NAA(是萘乙酸，为生长素的一种)0.5mg/L、蔗糖80.0g/L、琼脂4.5g/L、活性炭0.5g/L，调节pH为5.8～6.0，置于半固体培养基上培养；在光照时数12h/d、光照强度2500lux、培养温度25±2℃，培养蕲山药试管零余子 

按照所述的蕲山药试管零余子的繁殖方法，用带3～4片叶且去掉顶芽的蕲山药无根脱毒试管苗为外植体，直接接种于试管零余子诱导培养基上，培养周期为10w，试管零余子诱导率达93%以上，零余子发生个数达3.69个/株，每年生产4～5次。 

从上述操作步骤可以看出，与传统的大田生产零余子方法相比，本发明蕲山药试管零余子繁殖方法的优势主要表现在： 

由于采用蕲山药脱毒试管苗繁殖零余子，不仅可以选择优良性状的单株，而且可以改善品质，保持种的纯度，因此，可以克服大田生产零余子存在的不足；同时，本发明将生产周期从大田生产的1年，缩短为10w，每年可生产4～5次。采用本发明的方法可进行蕲山药试管零余子工厂化生产，单位面积培养室可年产零余子11～15万个（见表1），可节省大量人工和土地，成本较低，生产效率较高。 

表1  2012年蕲山药试管零余子生产效率统计 

具体实施方式

外植体蕲山药脱毒试管苗的培育： 

春季选择蕲山药健壮块茎催芽，待芽长8～10cm时剪芽并置于自来水下流水冲洗50min后，酒精消毒5～10s，5%漂白粉溶液消毒10min，无菌水冲洗5～6次；在解剖镜下剥取带叶原基的茎尖，接种于含蕲山药MS茎尖培养基的试管中，在25℃、3000lux和12h/d光照下培养至茎尖长成3～4片叶的小植株，将小植株切段扩繁为试管苗备用。 

实施例1 

蕲山药试管零余子培养基设计：改良的MS培养基（NH₄NO₃含量为MS的1/4），添加BA1.0mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖80.0g/L、琼脂4.5g/L、活性炭0.5g/L，调节pH为5.8～6.0；配制成半固体培养基，每瓶分装培养基25ml，置于121℃高压灭菌22min，冷却备用；每瓶接种带3～4片叶、去掉顶芽的蕲山药无根脱毒试管苗4株，置于组培室内培养10w；培养条件：光照强度2500lux，光照时数12h/d，培养温度25±2℃。每1000个培养瓶共计收获试管零余子6993个。 

实施例2 

蕲山药试管零余子培养基设计：改良的MS培养基（NH₄NO₃含量为MS的1/2），添加BA1.0mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖80.0g/L、琼脂4.5g/L、活性炭0.5g/L，调节pH为5.8～6.0；配制成半固体培养基，每瓶装培养基25ml，置于121℃高压灭菌22min，冷却备用；每瓶接种带3～4片叶、去掉顶芽的蕲山药无根脱毒试管苗4株，置于组培室内培养10w；培养条件：光照强度为2500lux，光照时数12h/d，培养温度25±2℃。每1000个培养瓶共计收获试管零余子14660个。 

实施例3 

蕲山药试管零余子培养基设计：改良的MS培养基（NH₄NO₃含量为MS的3/4），添加BA1.0mg/L、NAA0.5mg/L、蔗糖80.0g/L、琼脂4.5g/L、活性炭0.5g/L，调节pH为5.8～6.0；配制成半固体培养基，每瓶装培养基25ml，置于121℃高压灭菌22min，冷却备用；每瓶接种带3～4片叶、去掉顶芽的蕲山药无根脱毒试管苗4株，置于组培室内培养10w；培养条件：光照强度为2500lux，光照时数12h/d，培养温度25±2℃。每1000个培养瓶共计收获试管零余子10955。