一种从大青叶中分离纯化(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法

摘要

本发明涉及一种从大青叶中分离纯化(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法。该方法包括五步骤：A.匀浆破碎酶解：大青叶进行匀浆破碎，加入纤维素酶、果胶酶或两者组成的复合酶进行酶解；B.负压空化强化提取：甲醇、乙醇或醇水混合溶液进行负压空化强化提取；C.树脂富集：上样进入大孔吸附树脂柱，用30%～35%乙醇、50%～60%乙醇分步洗脱吸附有目标物的大孔吸附树脂；D.色谱分离：用90%甲醇溶解样品后，进入Toyopearl HW-40S凝胶树脂柱，梯度洗脱，分段收集流份；E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇结晶得到纯度均大于95%的(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素产品。本发明方法步骤少，耗时短，溶剂消耗少，更加经济环保，且得率高，适合于规模化生产，具有较高的经济价值。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从大青叶中快速大量分离纯化高纯度(＋)-异落 叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法。

背景技术

大青叶是我国的传统中药，为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的叶子。性味苦寒， 归心、胃经。具有清热解毒、凉血消斑的功效，临床上则用作治疗各种病毒性流行感冒、流 行性腮腺炎和病毒性肝炎等感染性疾病(仲卫国等，2011)。药理研究表明，其具有抗病毒、增 强免疫力、抗内毒素、抗肿瘤、保肝利胆、抗菌、解热、抗炎等生物学活性(郑雪花，2007)。

(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素是大青叶的重要的有效成分。中国专利(公开号 1704066)“异落叶松树脂醇的药物用途”，该专利公开的结果表明(＋)-异落叶松树脂醇能显著 降低内毒素诱发的多脏器功能衰竭所致的小鼠死亡率。体内活性研究表明(－)-落叶松脂素具 有显著的抗炎和抗感受伤害作用(KüpeliE.et al，2003)。另有研究表明落叶松脂素还具有抗真 菌和调控树突状细胞功能的作用(Hwang B.et al，2011；戴先坤，2010)。尽管从植物中获得 的(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的活性突出，但目前关于其分离纯化的报道较少 (柳继锋等，2006；李彬等，2005；刘海利等，2002)，并且在这些报道中采用传统的提纯技 术手段，需要进行有机溶剂萃取和正相硅胶柱层析，过程漫长、目标化合物易损失，而且毒 性较大的有机试剂氯仿、二氯甲烷等使用量大，不利于环保与健康。

发明内容

本发明旨在克服上述缺陷，提供一种从大青叶中快速大量分离纯化高纯度(＋)-异落叶松 树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种从大青叶中分离纯化(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法，其特征在于按 如下工艺步骤进行：

A.匀浆破碎酶解：新鲜或干燥大青叶按质量体积比加入4～10倍原料质量的水进行匀浆破碎 3～10min，用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调节浆液pH为4.0～5.5，加入纤维素酶、果胶酶或 两者组成的复合酶使酶浓度为350～750U/mL，然后在35～55°C条件下酶解1～5h，过 滤，收集滤液、滤渣。

B.负压空化强化提取：上述滤渣按质量体积比加入8～25倍滤渣质量的甲醇、乙醇或醇水混 合溶液进行负压空化强化提取，提取温度为室温至50°C，提取压力为-0.05～-0.09MPa， 提取2～4次，每次20min～60min，合并提取液与步骤A所得滤液，减压回收除去溶剂， 得到大青叶浸膏。

C.树脂富集：上述大青叶浸膏按质量体积比分散于10～30倍浸膏质量的20%乙醇中后，上 样进入大孔吸附树脂柱，上样体积为3～15倍柱体积，然后先用30%～35%乙醇充分洗脱， 弃去洗脱液，再用50%～60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收除去溶剂，得到树脂富集 物。所述的大孔吸附树脂包括AB-8、X-5、H1020、D101、HPD826、HPD600、ADS-5 和NKA-9型大孔吸附树脂。

D.色谱分离：上述树脂富集物加入90%甲醇至刚好溶解后进行连续中压色谱柱层析。其中， 层析柱填料为Toyopearl HW-40S凝胶树脂；上样体积为柱体积的1/12～1/6；梯度洗脱依 次选用的洗脱剂为90%甲醇、纯甲醇和丙酮，分段收集流份，得到(＋)-异落叶松树脂醇流 份和(－)-落叶松脂素流份，然后分别减压浓缩至干，得到(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)- 落叶松脂素粗品。

E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇反复重结晶得到纯度均大 于95%的(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素。

本发明具有如下优点：

(1)步骤少，耗时短，得率高，操作简便，适合大规模生产。

(2)采用匀浆破碎酶解技术，粉碎过程不产生粉尘，安全绿色，并具有破坏细胞壁、使 植物细胞和酶充分接触以及瞬时刺激诱发内源性酶活性的作用。

(3)树脂富集步骤中，分步洗脱使大部分大极性的糖苷和有机酸以及弱极性的生物碱被 除去，大大提高了富集物中(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的含量。

(4)采用连续中压凝胶树脂柱色谱分离，无死吸附，极大提高得率，并且试剂毒性小， 替代了硅胶柱层析常用的氯仿、二氯甲烷等高毒性试剂，更加快速、安全、环保。

附图说明

图1为(＋)-异落叶松树脂醇的结构

图2为(－)-落叶松脂素的结构

具体实施方式

实施例1

一种从大青叶中快速大量分离纯化高纯度(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方 法，按如下工艺步骤进行：

A.匀浆破碎酶解：1kg干燥大青叶加入5L水进行匀浆破碎5min，用盐酸调节浆液pH为4.0， 加入纤维素酶使酶浓度为500U/mL，然后在40°C条件下酶解3h，过滤，收集滤液、滤 渣。

B.负压空化强化提取：上述滤渣加入17L乙醇进行负压空化强化提取，提取温度为45°C， 提取压力为-0.06MPa，提取2次，每次50min，合并提取液与步骤A所得滤液，减压回 收除去溶剂，得到大青叶浸膏170g。

C.树脂富集：上述大青叶浸膏分散于4.5L20%乙醇中后，上样进入NKA-9大孔吸附树脂柱， 上样体积为12倍柱体积，然后先用35%乙醇充分洗脱，弃去洗脱液，再用55%乙醇洗脱， 收集洗脱液，减压回收除去溶剂，得到树脂富集物9.3g。

D.色谱分离：上述树脂富集物加入90%甲醇至刚好溶解后进行连续中压色谱柱层析。层析柱 填料为Toyopearl HW-40S凝胶树脂；上样体积为柱体积的1/7；梯度洗脱依次选用的洗脱 剂为90%甲醇、纯甲醇和丙酮，分段收集流份，得到(＋)-异落叶松树脂醇流份和(－)-落叶 松脂素流份，然后分别减压浓缩至干，得到(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗 品。

E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇反复重结晶得到纯度为96% 的(＋)-异落叶松树脂醇295mg和纯度为96.6%的(－)-落叶松脂素276mg。

实施例2

一种从大青叶中快速大量分离纯化高纯度(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方 法，按如下工艺步骤进行：

A.匀浆破碎酶解：1kg干燥大青叶加入7L水进行匀浆破碎8min，用冰醋酸调节浆液pH为 5.0，加入纤维素酶和果胶酶的复合酶使纤维素酶浓度为350U/mL、果胶酶浓度为200 U/mL，然后在45°C条件下酶解2h，过滤，收集滤液、滤渣。

B.负压空化强化提取：上述滤渣加入10L80%乙醇进行负压空化强化提取，提取温度为35°C， 提取压力为-0.075MPa，提取3次，每次30min，合并提取液与步骤A所得滤液，减压 回收除去溶剂，得到大青叶浸膏195g。

C.树脂富集：上述大青叶浸膏分散于3.5L20%乙醇中后，上样进入H1020大孔吸附树脂柱， 上样体积为6倍柱体积，然后先用30%乙醇充分洗脱，弃去洗脱液，再用50%乙醇洗脱， 收集洗脱液，减压回收除去溶剂，得到树脂富集物11.2g。

D.色谱分离：上述树脂富集物加入90%甲醇至刚好溶解后进行连续中压色谱柱层析。层析柱 填料为Toyopearl HW-40S凝胶树脂；上样体积为柱体积的1/10；梯度洗脱依次选用的洗 脱剂为90%甲醇、纯甲醇和丙酮，分段收集流份，得到(＋)-异落叶松树脂醇流份和(－)- 落叶松脂素流份，然后分别减压浓缩至干，得到(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂 素粗品。

E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇反复重结晶得到纯度为 97.5%的(＋)-异落叶松树脂醇393mg和纯度为96.9%的(－)-落叶松脂素356mg。