一种重组型核酸建构物及使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法

摘要

一种核酸建构物，可调控且有效破裂菌株，将菌株胞内生产的重组蛋白释放于胞外，以达到方便且快速回收胺基酸组成物的目的。此核酸建构物包括一个控制表现基因的核酸物，以及可被诱导表现的基因产物；其中，一个控制表现基因的核酸物包含了一个热敏感性抑制蛋白(heat-sensitive repressor protein)CI857基因，λPRPL启动子和热休克蛋白(heat shock protein)groEL启动子，及一个lacO控制子位置(operator site)；而可被诱导表现的基因产物包括一个噬菌体φX174溶菌基因E，结合一个噬菌体T4溶酶素基因或一个T7溶酶素基因。以生产Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291amidohydrolase(AHL)以及hydantoinase(HDT)为实施例，生产菌株具有此核酸建构物，一经温度诱导作用后，生产菌株生长随即停止，且可有效将诱导生产的重组型AHL以及HDT释放至胞外。

说明书

技术领域

本发明是关于一种重组型核酸建构物及使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法，尤其关于一种在大肠杆菌生产重组蛋白质的工业化制程中，自培养基快速回收大肠杆菌所释出的蛋白质的方法。 

背景技术

人类基因体计划(Human genome project)的终极目标在于勾画出生命的基本蓝图，以便人类能藉此得以了解生理机能及窥探生命奥妙的所在；另一方面，科学家也可藉此按图索骥以破解人类基因之谜，并运用生物关键技术来解决人类遗传疾病的问题，以及发展促进人类未来福祉等相关生物技术。由于这个堪称为二十一世纪人类最伟大计划的顺利推展，也推动了许多真核和原核生物细胞基因体计划的热潮，可预期的是，未来我们将更了解许多基因的基本功用和追溯出相仿蛋白质家族间的演化历程及相关性，以及更进一步了解蛋白质体之间的相互作用对于一个细胞基本生命运作的意义。尤为重要的是，许多具有特殊功用的蛋白质亦将陆续被发现和被运用来增进人类的福祉，而重组基因技术将在此刻扮演最关键的角色。这项技术影响范围将涉及化学工业、生技医药工业、农牧渔业、能源、环境净化等领域，例如重组基因技术可将我们有兴趣的目标基因(target gene)选殖至一个适当的载体(vector)上，随后将所形成的重组型载体输送至一胜任的宿主细胞(competent host cell)中，由此所形成的重组型宿主细胞可于一适当的培养基与培养条件下进行培养，并于适当时机诱导该目标基因的表现，以大量合成所需的重组型蛋白质，这些重组型蛋白质可包括工农业用酵素、木质纤维素水解酶、治疗性蛋白质(therapeutic proteins)、干扰素(interferons)、间白素(interleukins)、激素(hormones)、生长激素(growth hormones)、抗原性多肽 (antigenic polypeptides)、抗体(antibodies)等各类产品。 

利用细菌细胞如大肠杆菌作为宿主细胞来生产重组蛋白质，目前仍是最具有经济、简单、方便等竞争条件，其原因在于大肠杆菌易于培养且生长速率快， 而所需营养基质较经济、简单，并且容易将培养体积放大，菌株对于酸酵的环境条件变化较不敏感，尤其可于细胞内大量累积生产重组蛋白质。然而大肠杆菌缺乏将蛋白质外泌到细胞外的能力，因此为了纯化于胞内累积生产的重组型蛋白质时，工业传统的方法就必须使用破菌的机械设备，将胞内释放出来。 

藉由大肠杆菌生产重组型蛋白质的工业化下游纯化程序，主要包括(1)菌株离心回收，(2)回收菌株破裂，(3)菌液分离，(4)蛋白质纯化，(5)包装等；传统的制程，使用工业级连续式离心机将发酵后的菌株离心回收，并利用工业级的均质机予以打破，以便将于细胞内生产的蛋白质释出。然而工业级连续式离心机价格昂贵，处理时间冗长，且菌株回收效率有限；此外，工业级的均质机破菌效果相当有限，也耗费时日。 

为了便于回收于大肠杆菌胞内生产的重组型蛋白质，Morita等人采用嗜菌体T4溶菌基因Gpt和嗜菌体T7溶酶素来破裂大肠杆菌(Biotechnol.Prog.，2001，17：573-576)。溶菌基因Gpt是一种已知可作用于细胞膜的蛋白质holin，而嗜菌体T7溶酶素具有可分解细胞壁的功能。Morita等人将Gpt和T7溶酶素基因选殖(clone)在一个载体上，并使用T7基因表现系统，以T7启动子来调控此两个基因的表现。以生产重组型β-glucuronidase(GUS)为例，实验结果显示，当使用1mM isopropyl-β-D-galactoside(IPTG)的诱导剂来强制表现Gpt和T7溶酶素，可有效达到细胞溶菌的效果，并能将重组型GUS释放于胞外。然而，以IPTG为诱导物难以达到工业化使用的目的，其主要原因为(1)IPTG的价格昂贵；(2)IPTG不被细菌代谢，易污染发酵液，而增加发酵产品纯化的困难度；(3)IPTG具有潜在的毒性，不适用于生产医疗用的产品；(4)为了达到均匀诱发细胞群的基因表现，需要使用高饱和剂量的IPTG。此外，T7基因表现是目前大肠杆菌中最强的基因表现系统，用来生产重组蛋白质最为有效。然而，该研究使用T7基因表现系统来控制Gpt和T7溶酶素的表现，此策略将使得目标蛋白无法使用T7基因表现系统来表现所欲生产的标的蛋白质，因此限制目标蛋白的生产效能；另一方面，Morita等人的研究报告中并未明述其标的蛋白质(GUS)释放出胞外的效率，以致难以评估其技术的效能。 

Jiae等人以Morita等人的研究技术为基础(J.Microbiol.Biotechnol.，2007， 17：1162-1168)，发展以ptsG P1启动子来调控Gpt和T7溶酶素的基因表现，以生产绿色荧光酶GFPuv和淀粉水解酶amylase为例，结果显示此技术虽然可以于胞外发酵液中侦测到绿色荧光酶和淀粉水解酶的活性，然经诱导后的细胞的生长却不受影响，意即无法有效达到细胞破裂的效果，同样的在此报告中也未具体叙述其标的蛋白质释放出胞外的效率。 

另一方面，Miksch等人则使用kil基因的功能来将生产于间膜的蛋白质释放出胞外(Appl.Mirobiol.Biotechnol.，1997，47：530-536)，以生产葡聚醣酶β-glucanase为例，其结果显示此技术不会造成细胞破裂，但可将生成于间膜的葡聚醣酶释放于胞外发酵液中；然而，细胞间膜乃位于大肠杆菌的外膜和内膜的狭小空间，由于细胞质的空间远大于间膜，因此相对于间膜空间，欲生产的蛋白质在细胞质内较可大量累积生产；并且，kil基因产物可助于间膜蛋白质的释放，这意谓着细胞外膜结构受到改变而导致产生泄漏的现象，因此在工业化发酵规模所产生巨大剪应力的状况下，细胞不易于放大培养，进而限制了此技术的应用性。 

发明内容

本发明技术乃于生产细胞内建构一种利用温度来诱导溶菌作用的系统，当生产菌于酸酵后，随即提高酸酵液的温度来诱发溶菌系统，以促使生产标的蛋白质的大肠杆菌破裂，而无须以工业级连续式离心机离心回收菌株，再使用工业级的均质机进行破菌处理，可说是将传统处理方法的回收菌和破菌二步骤合而为一，可有效简化处理程序、减少设备的投资，并进而大幅提升重组蛋白质的纯化效能。此外，使用本技术，除不需要在现有设备上进行大幅度的升级外，且可广泛运用于各种重组型蛋白质的生产，极具工业应用价值。 

附图说明

图1：质体pPL-φXE的基因图谱。 

图2：质体pPL*-φXE的基因图谱。 

图3(A)：质体pCL*-φXEO的基因图谱。 

图3(B)：质体pET20bI-T4E的基因图谱。 

图3(C)：质体pCL*-φXT4E的基因图谱。 

图4：质体pCL*H-φXT4E的基因图谱。 

图5(A)：质体pET20bI-T7E的基因图谱。 

图5(B)：质体pCL*H-φXT7E的基因图谱。 

图6：本发明快速回收胺基酸组成物的方法流程图。 

图7：本发明收获重组型菌株释出至培养基中的物质的步骤流程图。 

图8：含有质体 的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

图9：含有质体 的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

图10：含有质体pCL*-φXEO或pCL*-φXT4E的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

图11：含有质体 的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

图12：含有质体 的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

图13：重组型AHL蛋白质的硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析图。 

图14：重组型HDT蛋白质的硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析图。 

具体实施方式

一般实验方法与材料 

本发明中采用的实验方法以及用于DNA选殖(DNA cloning)的是参考本技艺中所详知的教科书：(Sambrook J，Russell DW(2001))Molecular Cloning：aLaboratory Manual.3^rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，例如限制酶剪切DNA片段反应(cleavage reaction by restricting enzyme)、使用T4DNA黏接酶(ligase)黏接DNA片段反应(DNA ligation with T4DNA ligase)、聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)、琼脂凝胶电泳(agarose gelelectrophoresis)、硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)和质体转形(transform)等，这些技术都是熟悉此项技术的人士均可根据本身的专业素养来实施。例如，于下面的 实施例中所使用的大肠杆菌质体转形法是以经氯化钙(CaCl₂)处理的胜任细胞(calcium chloride-treated competent cell)来进行。此外、细菌培养液密度是使用分光亮度计(V530，Jasco)测量，测定波长为550nm，所得到的吸光值记录为OD₅₅₀。蛋白质浓度分析则是使用蛋白质分析试剂(Protein assay Reagent，BioRad Co.)，进行总蛋白质的定量，个别标的的蛋白质则是以影像分析仪(AlphaImagerEP，AlphaInnotech)来分析经凝胶电泳分离的蛋白质加以定量的。 

细菌及噬菌体染色体(chromosome)、质体(plasmid)和DNA片段的纯化则分别使用 Genomic DNA Purification kit(Promega Co.)、High-SpeedPlasmid Mini kit(Geneaid Co.)和Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit(GeneaidCo.)等商业纯化药品组。点突变使用 Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene Co.)、限制酶(Restriction enzyme)购自New England Biolabs以及Fermentas Life Science，T4DNA黏接酶和Pfu DNA聚合酶(polymerase)购自Promega Co.，聚合酶连锁反应中所须的引子(primers)由明欣生物科技公司(台北)及源资生物科技公司(台北)合成。 

DNA选殖(cloning)过程中所使用的中介细胞为大肠杆菌DH5α(StratageneCo.)、BW25142(Haldimann and Wanner，2001，J.Bacteriol.，183：6384-93)与BL21(DE3)(Invitrogen Co.)，细菌以LB液体营养基培养，而经转形的菌种则在培养基中添加抗生素培养，抗生素用量如安培西林(ampicillin)为50μg/mL，康纳霉素(kanamicin)为50μg/mL。 

Agrobacterium radiobacter NRRL B11291amidohydrolase(AHL)的活性测试是将样品与反应溶液(最终浓度：20mM CpHPG、1mMEDTA以及10mMsodiumphosphate buffer，pH＝6.6～6.8)于40℃反应20分钟后，以100℃加热10分钟以终止反应，并以12,000rpm离心10分钟，取上清液进行HPLC分析。HPLC分析使用C18管柱(250mm×4.6mm，Bos Hypersil)，mobile phase为2mM醋酸铵(pH＝3.2)∶甲醇＝91∶9体积比的溶液，并以波长280nm的UV进行讯号侦测。A.radiobacter NRRL B11291hydantoinase(HDT)的活性测试与AHL相似，仅将反应溶液改为最终浓度为10mM HPG，0.1M Tris buffer，pH＝8.0及0.5mMMnCl₂的溶液。酵素活性的定义则为每单位酵素活性(U)＝产物生成量(μmole) /反应时间(min)。 

在本发明中，温度诱导作用是将细菌培养温度由原培养温度提升为介于摄氏35至50度之间的一较高培养温度，维持至少二十分钟，再将培养温度降至原培养温度。其中该温度诱导作用的较佳实施态样为先以摄氏37度作为原培养温度，接着将培养温度提升至摄氏42度，维持一小时，再将培养温度降温至摄氏37度。 

实施例一：构筑温度诱导作用型重组型核酸建构物pPL-Φxe 

温度诱导作用型重组型核酸建构物 含有λP_RP_L启动子(promoter)驱动表现的噬菌体φX174溶菌基因E(φXe)、多样选殖位置(multiple cloningsite)、受P_RM启动子调控的热敏感性抑制蛋白(heat-sensitive repressor protein)CI857基因、来自大肠杆菌的pMB1质体复制区域(replication origin)、抗安培西林基因。其建构流程如下，首先根据美国国家生物科技信息中心(NCBI)基因体数据库φXe的核苷酸序列(Refseq：NC 001422)来合成φXe基因引子： 

顺向引子： 

(5’TTGCGCATATGGTACGCTGGACTTGTG3’) 

反向引子： 

(5’TTTTGAATTCAGACATTTTATCACTCCTTCCGCACG3’) 

上述顺向引子被设计含有限制酶NdeI的切割位置，而反向引子设计含有EcoRI的切割地址(如底线所标示者)。以从New England Biolabs购入的φX174噬菌体DNA做为模版，并以上述两个引子进行PCR反应，增幅出一含有φXe的片段(295bp)，以Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将增幅的基因片段进行纯化后，用限制酵素NdeI以及EcoRI切割此基因片段以及利用High-SpeedPlasmid Mini kit纯化的质体pPL452(Love et al.，1996，Gene 176：49-53)，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收后，利用T4黏合酶(T4ligase)将两个片段黏合后，依照前述”一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到温度诱导作用型溶菌质体pPL-φXE，质体图谱如图1所示。 

实施例二：构筑温度诱导作用型重组型核酸建构物 

温度诱导作用型重组型核酸建构物 含有λP_RP_L启动子驱动表现的φXe、多样选殖位置、受突变型P_RM启动子(P_RM*)调控的热敏感性抑制蛋白CI857基因、来自大肠杆菌的pMB1质体复制区域、抗安培西林基因。根据发表的文献(Jechlinger W.et al.，2005，J.Biotechnol.116：11-20)，P_RM*启动子强度较P_RM启动子增强，因此可增加热敏感性抑制蛋白CI857基因表现量，以有效抑制λP_RP_L启动子于未诱发状态下的表现。其建构流程如下，首先根据美国国家生物科技信息中心基因体数据库的pPL452序列(GenBank：AB248920.1)设计点突变引子，依照 Site-Directed Mutagenesis Kit的要求合成的引子序列如下： 

顺向引子： 

(5’GTAAAATAGCCAACACGCACGGTGTTAGATATTTATC3’) 

反向引子： 

(5’GATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGGCTATTTTAC3’) 

上述引子对含有单一核酸的突变位点(如底线标示处)，以实施例一建构的质体 为DNA模板，使用 Site-Directed Mutagenesis Kit进行点突变的PCR增幅反应，使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit将PCR片段回收后，利用T4黏合酶(T4ligase)将DNA片段黏合后，依照前述”一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到温度诱导作用型重组型核酸建构物 质体图谱如图2所示。 

实施例三：构筑温度诱导作用型重组型核酸建构物 

温度诱导作用型重组型核酸建构物 含有λP_RP_L启动子驱动表现的φXe和噬菌体(phage)T4溶酶素基因(Gpe)、受P_RM*调控的热敏感性抑制蛋白CI857基因、一个lacO控制子位置(operator site)、pSC101质体复制区域、抗链霉素基因。其建构流程如下，首先根据美国国家生物科技信息中心基因体数据库的lacO控制子位置设计引子序列： 

顺向引子： 

(5’GGATAACAATTGATCCTAAGGAGGTTGATCC3’) 

反向引子： 

(5’GCTCACAATTCCAATGCTTCGTTTCGTATCACACACC 3’) 

上述引子对含有一个lacO控制子位置(如底线标示处)，以实施例二建构的质体 为DNA模板，使用PCR增幅反应，使用Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit将PCR片段回收后，利用T4黏合酶(T4ligase)将DNA片段黏合后，依照前述”一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到温度诱导作用型重组型核酸建构物 接着将质体 以限制酵素PstI以及SmaI切割，以回收一段含有受P_RM*调控的热敏感性抑制蛋白CI857基因、lacO控制子位置、以及λP_RP_L启动子驱动表现的φXe基因片段；同时将含有pSC101质体复制区域及抗链霉素基因的质体pCL1920(Claude and Masayori，1990，Nucl.Acids Res.，18：4631)利用High-SpeedPlasmid Mini kit纯化后，使用限制酵素PstI以及SmaI剪切后，使用Gel/PCR DNAFragments Extraction Kit将酵素切割过的DNA片段回收，利用T4黏合酶(T4ligase)将上述两个DNA片段黏合后，依照前述”一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到低拷贝数(copy number)的温度诱导作用型重组型核酸建构物质体pCL*-φXEO，其质体图谱如图3(A)所示。 

接着，根据美国国家生物科技信息中心基因体数据库的噬菌体T4序列(Refseq：NC_000866.4)以及质体pET20bI(Wang ZW et al.，2004，Biotechnol.Prog.20：1352-1358)载体序列设计引子： 

顺向引子1： 

(5’GAGTTCATATGAATATATTTGAAATGTTAC3’) 

顺向引子2： 

(5’GATCCGAGCTCCCCTCTAGAAATAATTTTG3’) 

反向引子： 

(5’AGTAACTCGAGCCCGGGTTATAGATTTTTATACGCGTCC3’) 

上述引子中，顺向引子1设计为带有NdeI的切割位点(划底线的位置)，顺向引子2设计为带有SacI的切割位点(划底线的位置)，反向引子设计为带有 XhoI的切割位点(划底线的位置)。以 Genomic DNA Purification kit纯化的噬菌体T4DNA做为DNA模版，利用顺向引子1以及反向引子进行PCR，将Gpe基因(510bp)增幅出来，使用NdeI以及XhoI限制内切酶将PCR增幅出的DNA片段以及使用High-Speed Plasmid Mini kit纯化的质体pET20bI进行切割，切割后的DNA片段使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit回收，并使用T4黏合酶将Gpe基因与质体pET20bI黏合起来后，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pET20bI-T4E，其图谱如图3(B)所示。接着使用质体pET20bI-T4E作为DNA模版，利用顺向引子2以及反向引子进行PCR增幅，使用SacI以及XhoI限制内切酶将PCR增幅出的DNA片段以及使用High-Speed Plasmid Mini kit纯化的质体 进行切割，切割后的DNA片段使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit回收，并使用T4黏合酶将回收的两段DNA黏合起来后，依”一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到温度诱导作用型重组型核酸建构物 质体的基因图谱如图3(C)。 

实施例四：构筑温度诱导作用型重组型核酸建构物 

本发明的重组型核酸建构物，在其一种实施例中包含一噬菌体φX174溶菌基因E的核酸序列、一噬菌体T4溶酶素基因的核酸序列、一热敏感性抑制蛋白(heat-sensitive repressor protein)CI857基因的核酸序列、一λP_RP_L启动子的核酸序列、一热休克蛋白(heat shock protein)groEL启动子的核酸序列、以及一lacO控制子位置的核酸序列，在此实施例中将它称为温度诱导作用型重组型核酸建构物 其制作方式如下所述： 

温度诱导作用型重组型核酸建构物 含有λP_RP_L启动子和热休克蛋白(heat shock protein)groEL启动子驱动表现的φXe和Gpe基因、受P_RM*调控的热敏感性抑制蛋白CI857基因、一个lacO控制子位置(operator site)、pSC101质体复制区域、抗链霉素基因。其建构流程如下，首先根据美国国家生物科技信息中心基因体数据库的大肠杆菌MG1655基因体序列(Refseq：NC_000913.2)设计引子： 

顺向引子： 

(5’GTCCGTCTAGACCCAAATTTTGGGCAACTGC 3’) 

反向引子： 

(5’CTCTCGGTACCGAAAGTCCGTATCTGTTATG3’) 

上述引子中，顺向引子设计为带有XbaI的切割位点(划底线的位置)，反向引子设计为带有KpnI的切割位点(划底线的位置)。以 Genomic DNAPurification kit纯化的大肠杆菌MG1655基因体做为DNA模版，利用顺向引子以及反向引子进行PCR，将groEL启动子基因(249bp)增幅出来，使用XbaI以及KpnI限制内切酶将PCR增幅出的DNA片段以及使用High-Speed PlasmidMini kit纯化的实施例三建构的质体 进行切割，切割后的DNA片段使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit回收，随之将纯化后的两DNA片段以T4黏合酶黏合起来，依”一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到温度诱导作用型重组型核酸建构物 质体图谱如图4所示。 

实施例五：构筑温度诱导作用型重组型核酸建构物 

本发明的重组型核酸建构物，在其一种实施例中包含一噬菌体φX174溶菌基因E的核酸序列、一噬菌体T7溶酶素基因的核酸序列、一热敏感性抑制蛋白(heat-sensitive repressor protein)CI857基因的核酸序列、一λP_RP_L启动子的核酸序列、一热休克蛋白(heat shock protein)groEL启动子的核酸序列、以及一lacO控制子位置的核酸序列，在此实施例中将它称为温度诱导作用型重组型核酸建构物 其制作方式如下所述： 

温度诱导作用型重组型核酸建构物 含有λP_RP_L启动子和热休克蛋白(heat shock protein)groEL启动子驱动表现的φXe和噬菌体T7溶酶素基因(T7e)基因、受P_RM*调控的热敏感性抑制蛋白CI857基因、一个lacO控制子位置(operator site)、pSC101质体复制区域、抗链霉素基因。其建构流程如下，首先根据美国国家生物科技信息中心基因体数据库的噬菌体T7序列(Refseq：NC_001604.1)以及质体pET20bI(Wang ZW et al.，2004，Biotechnol.Prog. 20：1352-1358)序列设计引子： 

顺向引子1： 

(5’AAGAACATATGGCTCGTGTACAGTTTAAAC3’) 

顺向引子2： 

(5’GATCCGAGCTCCCCTCTAGAAATAATTTTG3’) 

反向引子： 

(5’TTAGTCTCGAGCCCGGGTTATCCACGGTCAGAAGTGAC3’) 

上述引子中，顺向引子1设计为带有NdeI的切割位点(划底线的位置)，顺向引子2设计为带有SacI的切割位点(划底线的位置)，反向引子设计为带有XhoI的切割位点(划底线的位置)。以High-Speed Plasmid Mini kit纯化含有噬菌体T7溶酶蛋白基因的pLysS质体(Promega Co.)做为DNA模版，利用顺向引子1以及反向引子进行PCR，将噬菌体T7e基因(464bp)增幅出来，使用NdeI以及XhoI限制内切酶将PCR增幅出的DNA片段以及使用High-Speed PlasmidMini kit纯化的质体pET20bI载体进行切割，切割后的DNA片段使用Gel/PCRDNA Fragments Extraction Kit回收，并使用T4黏合酶将纯化后的两段DNA黏合起来后，依”一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到质体pET20bI-T7E。质体图谱如图5(A)。接着使用质体pET20bI-T7E为DNA模版，利用顺向引子2以及反向因子进行PCR增幅，使用SacI以及XhoI限制内切酶将PCR增幅出的DNA片段以及使用High-Speed Plasmid Mini kit纯化的实施例四建构的质体 进行切割，切割后的DNA片段使用Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit回收，并使用T4黏合酶将纯化后的两段DNA黏合起来后，依”一般实验方法”，将DNA黏合产物转形入大肠杆菌菌株DH5α中，而得到温度诱导作用型重组型核酸建构物 质体图谱如图5(B)。 

实施例六：温度诱导作用型重组型核酸建构物 的破菌效果 

利用前述”一般实验方法”，将实施例一建构的温度诱导作用型重组型核酸建构物 转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，以含有安培西林固态培养基 于30℃下培养，挑选单一菌落，培养于含有安培西林抗生素的LB培养液(10mL)的烧杯中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养，当细胞密度达OD₅₅₀＝0.3时，培养温度由30℃提高至37℃继续培养直到实验结束，实验结果如下图8所示，相对于未经温度诱导作用的菌株的生长曲线(实心圆)，经此温度诱导作用后的菌株的生长曲线(空心圆)呈现明显下降的趋势，显示诱导产生的噬菌体φX174溶菌基因E(φXe)可导致细菌死亡。不过，未经温度诱导作用的菌株的生长缓慢，显示温度诱导作用型重组型核酸建构物 对于温度过于敏感。 

图8含有质体 的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

符号说明：未实施温度诱导(●)；实施温度诱导(○)。 

实施例七：温度诱导作用型重组型核酸建构物 的破菌效果 

实施例六中显示温度诱导作用型重组型核酸建构物 对于温度过于敏感，不利于实际运用，因此如实施例二所述进行建构温度诱导作用型重组型核酸建构物 利用前述”一般实验方法”，将温度诱导作用型重组型核酸建构物 转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，以含有安培西林固态培养基于30℃下培养，挑选单一菌落，培养于含有安培西林抗生素的LB培养液(10mL)的烧杯中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养，当细胞密度达OD₅₅₀＝0.3时，培养温度由30℃提高至39℃或42℃，一小时后回温至37℃继续培养直到实验结束，实验结果如下图9所示，相对于未经温度诱导作用的菌株的生长曲线(空心圆)，以39℃诱导的菌株的生长(实心圆)并无影响，不过两者菌株的生长均相当缓慢；然而以42℃诱导的菌株的生长曲线(空心正方形)则呈现明显下降。以上这些结果显示温度诱导作用型重组型核酸建构物 对于温度较不敏感，而以高温(如42℃)诱导产生的噬菌体φX174溶菌基因E(φXe)可导致细菌死亡。 

图9含有质体 的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

符号说明：未实施温度诱导(●)；提升培养温度至39℃以实施温度诱导(○)；提升培养温度至42℃以实施温度诱导(□)。 

实施例八：温度诱导作用型重组型核酸建构物 的破菌效果 

实施例七中显示虽未经温度诱导作用，含有温度诱导作用型重组型核酸建构物 的菌株生长迟缓，表示噬菌体φX174溶菌基因E(φXe)在未诱导的条件下仍有微量表现，不利于实际运用，因此如实施例三所述进行建构温度诱导作用型重组型核酸建构物 利用”一般实验方法”，将温度诱导作用型重组型核酸建构物 转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，以含有安培西林固态培养基于30℃下培养，挑选单一菌落，培养于含有安培西林抗生素的LB培养液(10mL)的烧杯中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养直到实验结束，实验结果如下图10所示，相对于含有温度诱导作用型重组型核酸建构物 的菌株的生长(参考图9空心圆)，含有温度诱导作用型重组型核酸建构物 的菌株生长状况(实心圆)良好，显示噬菌体φX174溶菌基因E(φXe)的表现可受到严密控制。 

图10含有质体pCL*-φXEO或pCL*-φXT4E的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

符号说明：未实施温度诱导的含有质体 的菌株(●)；实施温度诱导的含有质体 的菌株(○)；实施温度诱导的含有质体 的菌株(□)。 

此外，为了检视温度诱导作用型重组型核酸建构物 于细胞生长后期诱发的效能，如前所述的培养方式，首先将含有温度诱导作用型重组型核酸建构物 的菌株过夜培养后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养，当细胞密度达OD₅₅₀＝2.5时，培养温度由30℃提高至42℃， 一小时后回温至37℃继续培养直到实验结束，实验结果如图10所示，受温度诱导作用的菌株的生长曲线(空心正方形)略呈下降，显示经诱导生产的噬菌体φX174溶菌基因E无法有效引发菌株死亡。 

为了进一步提升菌株破裂的效能，因此如实施例三所述进行建构温度诱导作用型重组型核酸建构物 利用”一般实验方法”，将温度诱导作用型重组型核酸建构物 转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，以含有安培西林固态培养基于30℃下培养，挑选单一菌落，培养于含有安培西林抗生素的LB培养液(10mL)的烧杯中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养，当细胞密度达OD₅₅₀＝2.5时，培养温度由30℃提高至42℃，一小时后回温至37℃继续培养直到实验结束，实验结果如图10所示，然受温度诱导作用的菌株的生长曲线(空心圆)仍略呈下降，显示经诱导生产的噬菌体φX174溶菌基因E和噬菌体T4溶酶素(Gpe)无法有效引发菌株死亡。 

实施例九：温度诱导作用型重组型核酸建构物 的破菌效果 

为了进一步提升菌株破裂的效能，因此如实施例四所述建构温度诱导作用型重组型核酸建构物 利用”一般实验方法”，将温度诱导作用型重组型核酸建构物 转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，以含有安培西林固态培养基于30℃下培养，挑选单一菌落，培养于含有安培西林抗生素的LB培养液(10mL)的烧杯中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养，当细胞密度达OD₅₅₀＝2.5时，培养温度由30℃提高至42℃，一小时后回温至37℃继续培养直到实验结束，实验结果如下图11所示，未经温度诱导作用的菌株的生长良好(实心圆)，然以42℃诱导的菌株的生长曲线(空心圆)则呈现明显下降，显示此温度诱导作用型重组型核酸建构物可在细胞生长后期以高温诱发，而诱导生产的噬菌体φX174溶菌基因E(φXe)及噬菌体T4溶酶素(Gpe)可有效导致细菌死亡。 

图11含有质体 的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

符号说明：未实施温度诱导(●)；实施温度诱导(○)。 

实施例十：温度诱导作用型重组型核酸建构物 的破菌效果 

此外，如实施例五所述进行建构温度诱导作用型重组型核酸建构物 利用”一般实验方法”，将温度诱导作用型重组型核酸建构物 转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，以含有安培西林固态培养基于30℃下培养，挑选单一菌落，培养于含有安培西林抗生素的LB培养液(10mL)的烧杯中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养，当细胞密度达OD₅₅₀＝2.5时，培养温度由30℃提高至42℃，一小时后回温至37℃继续培养直到实验结束，实验结果如下图12所示，未经温度诱导作用的菌株的生长良好(实心圆)，然以42℃诱导的菌株的生长曲线(空心圆)则呈现明显下降，显示此温度诱导作用型重组型核酸建构物可在细胞生长后期以高温诱发，而诱导生产的噬菌体φX174溶菌基因E(φXe)及噬菌体T7溶酶素(T7e)可有效导致细菌死亡。 

图12含有质体 的大肠杆菌BL21(DE3)的生长曲线。 

符号说明：未实施温度诱导(●)；实施温度诱导(○)。 

实施例十一：运用温度诱导作用型重组型核酸建构物 来释放菌株胞内生产的重组型蛋白质 

如实施例十所示，温度诱导作用型重组型核酸建构物 可在细胞生长后期以高温诱发破菌效果，由于生产细胞生长至后期可大量累积重组型蛋白质，如此可以于破菌后增进重组型蛋白质的胞外释放量。为了检测此系统释放菌株胞内生产的重组型蛋白质的效率，在此以生产Agrobacteriumradiobacter NRRL B 11291amidohydrolase(AHL)为例，将质体 和质体pChA203(Chiang CJ.et al.2008，J.Agri.Food Chem.56，6348-6354)同时转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，其中质体pChA203含有T7启动子驱动表现 的AHL基因、pMB1质体复制区域(replication origin)、抗安培西林抗生素基因。以含有链霉素和安培西林抗生素固态培养基于30℃下培养，挑选单一菌落，培养于含有安培西林和康纳霉素抗生素的LB培养液(10mL)的烧杯中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有链霉素和安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养，当细胞密度达OD₅₅₀＝0.3时加入1mM IPTG，以诱发生产重组型AHL，随后当细胞密度达OD₅₅₀＝1.5(早期对数生长期)、OD₅₅₀＝3.0(中期对数生长期)或OD₅₅₀＝4.5(晚期对数生长期)时，再将培养温度由30℃提高至42℃，一小时后回温至37℃继续培养，以诱发破菌效应。酸酵时间结束后，使用离心机将培养液于4℃、6000rpm的条件下离心，随后将上层液回收(即培养液)，依据”一般实验方法”的程序，使用SDS-PAGE分析15μL培养液中所含的可溶性蛋白质，由下图13显示，未加入IPTG诱导剂的培养液中(径1)中无法侦测到重组型AHL，而加入IPTG诱导剂但未进行温度诱导作用的培养液中(径2)只能侦测到极微量的重组型AHL，然而经温度诱导作用后的培养液中则累积了大量重组型AHL(径3-5)。另根据SDS-PAGE分析目标蛋白质的释放率，其定义为：(目标蛋白质于培养液中的质量)/(目标蛋白质于培养液中的质量+目标蛋白质残留于菌株胞内的质量)；由表一(A)中可得知，于菌株的早期对数生长期实施温度诱导作用时，AHL释放率达87％；于菌株的中期对数生长期实施温度诱导作用时，AHL释放率可达93％；而于菌株的晚期对数生长期实施温度诱导作用时，AHL释放率则达70％。经检测释放于培养液的AHL酵素活性，结果显示，于菌株的早、中、晚期对数生长期实施温度诱导作用时，释放于培养液的AHL的酵素活性分别可达400、1990、2840U/L。综合以上的结果，足以显示本发明技术的核酸建构物具有极佳的破菌效果，且无论于菌株生长的任何时期，皆可有效诱发来释放菌株胞内的蛋白质。 

图13重组型AHL蛋白质的硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析图。 

符号说明：径M，蛋白质标准品(Fermentas)；径1，未实施诱导的菌株培养液；径2：加入IPTG诱导剂，且于早期对数生长期实施温度诱导后的菌株培 养液；径3：加入IPTG诱导剂，且于中期对数生长期实施温度诱导后的菌株培养液；径4：加入IPTG诱导剂，且于晚期对数生长期实施温度诱导后的菌株培养液。箭头指示诱导生成的重组型AHL酵素的位置。 

表一(A)含有热诱导型质体 菌株胞内生产的重组型蛋白质AHL的释放率和酵素活性。 

实施例十二：运用温度诱导作用型重组型核酸建构物 来释放菌株胞内生产的重组型蛋白质 

如实施例九所示，温度诱导作用型重组型核酸建构物 可在细胞生长后期以高温诱发破菌效果，由于生产细胞生长至后期可大量累积重组型蛋白质，如此可以于破菌后增进重组型蛋白质的胞外释放量。为了检测此系统释放菌株胞内生产的重组型蛋白质的效率，在此以生产A.radiobacter NRRLB11291hydantoinase(HDT)为例，利用”一般实验方法”，将温度诱导作用型重组型核酸建构物 和质体pChHDT(Chern JT and Chao YP.2005，J.Biotechnol.117：267-275)，同时转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，其中质体pChHDT含有T7启动子驱动表现的HDT基因、pMB1质体复制区域(replicationorigin)、抗安培西林抗生素基因。同时转形至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，以含有链霉素和安培西林抗生素固态培养基于30℃下培养，挑选单一菌落，培养于含有链霉素和安培西林抗生素的LB培养液(10mL)的烧杯中，以30℃、200rpm培养隔夜后，接种至含有链霉素和安培西林抗生素的新鲜LB培养液(30mL)中，初始细胞密度达到OD₅₅₀＝0.08，接着于30℃、200rpm下进行继代培养，当细胞密度达OD₅₅₀＝0.3时加入1mM IPTG，以诱发生产重组型HDT，随后当 细胞密度达OD₅₅₀＝1.5(早期对数生长期)、OD₅₅₀＝3.0(中期对数生长期)或OD₅₅₀＝4.5(晚期对数生长期)时，再将培养温度由30℃提高至42℃，一小时后回温至37℃继续培养，以诱发破菌效应。发酵时间结束后，使用离心机将培养液于4℃、6000rpm的条件下离心，随后将上层液回收(即培养液)，依据”一般实验方法”的程序，使用SDS-PAGE分析15μL培养液中所含的可溶性蛋白质，由下图14显示，未加入IPTG诱导剂的培养液中(径1)中无法侦测到重组型HDT，而加入IPTG诱导剂但未进行温度诱导作用的培养液中(径2)只能侦测到极微量的重组型HDT，然而经温度诱导作用后的培养液中则累积了大量重组型HDT(径3-5)。另根据SDS-PAGE分析目标蛋白质的释放率，其定义为：(目标蛋白质于培养液中的质量)/(目标蛋白质于培养液中的质量+目标蛋白质残留于菌株胞内的质量)；由表一(B)中可得知，于菌株的早期对数生长期实施温度诱导作用时，AHL释放率达84％；于菌株的中期对数生长期实施温度诱导作用时，AHL释放率可达92％；而于菌株的晚期对数生长期实施温度诱导作用时，AHL释放率则达71％。经检测释放于培养液的AHL酵素活性，结果显示，于菌株的早、中、晚期对数生长期实施温度诱导作用时，释放于培养液的AHL的酵素活性分别可达370、1170、1510U/L。综合以上的结果，足以显示本发明技术的核酸建构物具有极佳的破菌效果，且无论于菌株生长的任何时期，皆可有效诱发来释放菌株胞内的蛋白质。 

图14重组型HDT蛋白质的硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分析图。 

符号说明：径M，蛋白质标准品(Fermentas)；径1，未实施诱导的菌株培养液；径2：加入IPTG诱导剂，且于早期对数生长期实施温度诱导后的菌株培养液；径3：加入IPTG诱导剂，且于中期对数生长期实施温度诱导后的菌株培养液；径4：加入IPTG诱导剂，且于晚期对数生长期实施温度诱导后的菌株培养液。箭头指示诱导生成之重组型HDT酵素的位置。 

表一(B)含有热诱导型质体 菌株胞内生产的重组型蛋白质HDT的释放率和酵素活性。 

实施例十三：使用重组型核酸建构物快速回收胺基酸组成物的方法 

(a)构筑一第一核酸建构物，该第一核酸建构物包括一第一核酸序列及一第二核酸序列，其中该第一核酸序列包含有噬菌体φX174溶菌基因E，该第二核酸序列包含有噬菌体溶酶素基因； 

(b)构筑一质体含有一第二核酸建构物，其中该第二核酸建构物进一步包括一热敏感性抑制蛋白CI857基因的核酸序列，一λP_RP_L启动子的核酸序列，一热休克蛋白groEL启动子的核酸序列，及一lacO控制子位置的核酸序列； 

(c)将该第一核酸建构物植入该质体中，形成一重组型核酸建构物； 

(d)将步骤(c)所形成的该重组型核酸建构物转形至一个宿主细菌，得到一重组型菌株； 

(e)将该重组型菌株，培养于培养基中，经一温度诱导作用后，以使该第一核酸建构物表现，使细菌破裂而释出细胞内物质； 

(f)收获步骤(e)的该重组型菌株释出至培养基中的物质。 

其中步骤(a)所述的噬菌体溶酶素基因，可为T4噬菌体溶酶素基因或T7噬菌体溶酶素基因。 

其中步骤(f)收获的该物质包括一重组型蛋白质、一不可溶内含体(inclusion)、一滞留胞内的物质、及其组合。 

其中该重组型蛋白质包括蛋白质、酵素、抗体、胜肽、胺基酸、及其组合。其中该重组型蛋白质为重组型酵素。 

其中该温度诱导作用包含将培养温度由原培养温度提升至摄氏38至42度之间，维持至少三十分钟，再将培养温度降至原培养温度。 

所述原培养温度可为摄氏37度。 

其中该步骤(f)所述收获该些重组型菌株释出至培养基中的物质，进一步包括步骤： 

(1)将含有一特定基因产物的基因序列的核酸建构物植入步骤该重组型菌株中；以及 

(2)将步骤(1)的该重组型菌株培养于培养基中，在该重组型菌株产生该特定基因产物后，再经一温度诱导作用以使该第一核酸建构物表现，使细菌破裂而释出细胞内物质，接着收获培养基中的该特定基因产物。