利用子叶下表皮细胞死亡率鉴定棉花耐盐能力的方法

摘要

本发明涉及一种利用子叶下表皮细胞死亡率鉴定棉花耐盐能力的方法。步骤是:在棉花子叶期，选取厚度一致的叶片，轻轻撕取叶片的下表皮；将准备好的下表皮放到浓度为3.5M的NaCl溶液中处理10～15min；利用0.03～0.05%的中性红溶液对经盐溶液处理的表皮，染色5～10min；将经过活体染色的表皮放入pH值略高于7的自来水中浸泡3～5min，然后通过光学显微镜下观察表皮细胞的死亡情况，根据活细胞染成樱桃红色，死细胞不着色的原理，记载同一面积下的细胞死亡数，通过子叶下表皮细胞的耐盐能力确定棉花植株的耐盐能力。本发明能快速准确判断基因型的耐盐能力，省工省时，不受季节和环境的影响，提高了鉴定效率。

说明书

技术领域

本发明涉及农作物耐盐检测方法，具体是一种利用子叶下表皮细胞死亡率鉴定棉花耐盐能力的方法。

背景技术

目前，在植物耐盐鉴定方法上众说纷纭，可以归纳为直接鉴定法和间接鉴定法，直接鉴定包括发芽比较法、形态比较法和产量比较法等。间接鉴定就是通过生理生化分析手段研究植物在盐胁迫条件下生理代谢过程中的物质变化而进行耐盐鉴定，主要指标有：脯氨酸、质膜透性、叶绿素、K+/Na+、酶活性等。在棉花耐盐鉴定方面，同样由于试验条件、方法、材料的不同，结果也不尽相同，研究比较分散，欠深入，缺乏系统性、综合性。河北省农林科学院滨海农业研究所针对滨海盐碱土特点，编制了《棉花耐盐性鉴定评价技术规范》，为该地区棉花耐盐碱品种的筛选、种质资源的评价提供了理论依据。但是此技术规范均是在盐碱池和盐碱田间进行的，周期较长，对于大量的材料鉴定费时费力。因此，寻找简单、便捷、快速的鉴定方法是目前一项迫在眉睫的任务。

 在高渗环境下，植物细胞因液泡水分流失而出现的细胞质与细胞壁分离的现象，称为质壁分离。发生质壁分离的原因是当外界溶液的浓度大于细胞液浓度时，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，造成液泡失水，由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层伸缩性较大，从而使二者分开，反之，外界溶液浓度小于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质壁又复原。质壁分离是植物生活细胞所具有的一种特性，可以用来区分细胞的死活。

同样，棉花在受到盐胁迫时首先通过渗透势的改变引起细胞内容物的外流，出现质壁分离现象而导致细胞死亡。耐盐能力不同的棉花基因型，其叶表皮细胞在盐溶液中的死亡率有很大差异：在高盐溶液中处理一定时间，叶表皮细胞的死亡率能够快速准确的反映基因型的耐盐能力，细胞死亡率高的耐盐能力低，细胞死亡率低的耐盐能力高。

发明内容

本发明的目的皆在针对目前在棉花耐盐能力鉴定方法上不统一、欠深入、田间或盐池鉴定周期长、受外界环境影响大等缺点，提供一种利用子叶下表皮细胞死亡率鉴定棉花耐盐能力的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种利用子叶下表皮细胞死亡率鉴定棉花耐盐能力的方法，包括：表皮准备，高盐溶液处理，染色，制片及镜检。

所述表皮准备，是在棉花子叶期，选取厚度一致的叶片，轻轻撕取叶片的下表皮；

所述高盐溶液处理，是将准备好的表皮放到浓度为3.5M的NaCl溶液中处理10～15min；

所述染色，是利用0.03～0.05%的中性红溶液对经盐溶液处理的表皮，染色5～10min；

所述制片及镜检，是将经过活体染色的表皮，转移到pH值略高于7的自来水中，浸泡3～5 min，放到载玻片上，加盖玻片，放到10倍和40倍的光学显微镜下观察表皮细胞的死亡情况，根据活细胞染成樱桃红色，死细胞不着色的原理，记载同一面积下的细胞死亡数，通过子叶下表皮细胞的耐盐能力确定棉花植株的耐盐能力。

上述3.5M 的NaCl溶液确定为盐浓度临界值的原理：

撕取的棉花子叶下表皮放到1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M的NaCl溶液中，处理10～15 min，然后用0.04%的中性红染色8 min，用100倍光学显微镜下观察，1～2.5MNaCl溶液处理后的表皮细胞质壁分离程度低，细胞死亡率低，而且耐盐材料和敏盐材料间细胞死亡率差异不显著；NaCl溶液浓度越高，相同处理时间内的细胞质壁分离程度越严重。3M 和3.5M NaCl溶液处理的表皮细胞出现大量的死亡，耐盐材料的表皮细胞死亡率明显低于敏盐材料，而且之间表现显著差异， 3.5MNaCl溶液处理时，敏盐材料中棉所12比耐盐材料NY1的细胞死亡率明显增加，而对时间长短的灵敏性低，可重复性好。因此，把3.5M作为NaCl溶液的临界盐浓度。

上述染色原理：中性红是一种活体染色剂，呈弱碱性，，在pH6.4～8.0之间由红变黄，在微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而成樱桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁不着色。死细胞由于原生质变性凝固，细胞不能维持在液泡内，因此，中性红染色后，不产生液泡着色现象。

棉花子叶下表皮经中性红染色后，细胞被染成樱桃红色，全为活细胞，死细胞只能观察到玻璃胶状的细胞质，但是将棉花子叶下表皮放到盐溶液中处理一段时间，再用中性红染色后，部分细胞呈樱桃红色，为活细胞，没有着色的为死细胞。随着盐溶液浓度的提高或是处理时间的延长，液泡浓缩成圆球状。当盐浓度过高或是时间过长，细胞膜破损，细胞内外成一体，观察不到红色球团。

依照上述技术方案的本发明，只需20-30分钟就能准确的判断基因型的耐盐能力，省工省时，不受季节和环境的影响，提高了鉴定效率。通过该方法淘汰不耐盐的基因型，实现耐盐基因与丰产优质基因的结合，加速耐盐棉花新品种的选育，具有十分广阔的应用前景，且对其他作物的耐盐能力的快速鉴定具有重要的参考价值。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

①以植物细胞的质壁分离现象和中性红染料的着色原理为依据，只需少量的子叶，就能快速鉴定出植株的耐盐能力，具有方便、快捷、重复性好、费用低廉等优点。

②根据表皮细胞死亡率淘汰大量不耐盐的基因型，有效地缩减田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提高优良耐盐基因型的筛选效率，加速耐盐作物育种的步伐。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，目的仅在于更好地理解本发明内容。因此，所举实施例并不限制本发明的保护范围。

本实施例以NY1和中棉所12为例说明。

NY1是河北省农林科学院滨海农业研究所选育的耐盐新品系，耐盐能力强；中棉所12是不耐盐品种(经河北省地方标准棉花耐盐性鉴定技术规程鉴定)。通过塑料盒盐碱原土鉴定NY1和中棉所12的耐盐性。用0.4%的盐碱原土播种，观察出苗及长势情况。结果表明，NY1具有很强的耐盐性，而中棉所12的耐盐性较差。

选取棉花幼苗的一片子叶，撕取叶表皮放在3.5M的由化学纯NaCl配制的NaCl溶液中处理10min，然后用0.04%的中性红染色8min后，放到pH为7.2的自来水中浸泡5min，放到10倍和40倍的光学显微镜下观察，结果表明，在3.5 MNaCl溶液中处理10min，NY1的子叶下表皮细胞出现明显的质壁分离现象，盐胁迫引起的细胞死亡率在40%以内，而中棉所12的子叶下表皮细胞大量丧失活力，死亡率达到80%以上，NY1叶表皮细胞死亡率比盐敏感品种中棉所12的叶表皮细胞死亡率低很多。由于棉花植株的耐盐能力和叶表皮细胞的耐盐能力高度相关，通过统计叶表皮细胞死亡率，就能快速准确地筛选耐盐的棉花植株。由此得出：NY1是耐盐能力强的品种，而中棉所12属于不耐盐品种。