辅助评价仔猪初生重和断奶重的方法及其专用引物

摘要

本发明公开了一种辅助评价仔猪初生重和断奶重的方法及其专用引物。本发明提供了用于鉴定待测猪的CNN3基因组中多个位点（第二内含子第182位核苷酸、第三内含子第44位核苷酸、第四内含子第314位核苷酸）的多态性或基因型的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途如下：（1）辅助鉴定待测猪的初生重；（2）辅助评价待测猪的初生重；（3）辅助比较不同待测猪的初生重；（4）辅助鉴定待测猪的断奶重；（5）辅助评价待测猪的断奶重；（6）辅助比较不同待测猪的断奶重。本发明公开了猪CNN3基因组DNA序列中的三个位点的突变，以及单个SNP位点检测仔猪初生重、21日龄断奶重的生长性能的技术，为猪的标记辅助育种提供了新的标记。

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助评价仔猪初生重和断奶重的方法及其专用引物。

背景技术

猪为六畜之首，养猪业在世界尤其是中国国民经济中占有重要地位。猪肉在诸多 肉类产品中的比重一直保持在三分之一左右，是人们比较喜爱的副食之一。随着人们 生活品质不断改善，传统的养殖技术已经不能满足人们对猪肉的需求量。随着现代育 种技术的发展，猪的生产性能显著提高，猪的健康养殖和育肥就显得格外重要。仔猪 初生重和断奶重不仅关系到种猪的选育，生猪的生长发育、死亡率，而且还直接影响 后期育肥效果。大量数据表明，仔猪初生重大的仔猪增重显著，猪场经济效应高。然 而，仔猪初生重和21日龄断奶重只能在仔猪出生后才能判定，不仅可预见性低，而且 影响种猪的选育等多种方面。因此，如何有效提高仔猪初生重和断奶重，是每个猪场 经营者及育种学家追求的目标。

近十年来，分子生物技术的发展为猪的育种提供了一种基于DNA变异的新型遗传 标记。特别是分子标记辅助选择技术的出现，为显著改善猪的这些数量性状提供可能。

猪CNN3基因，又名calponin 3，acidic，是钙结合蛋白家族中的一员，位于4 号染色体上，全基因组长24595bp，编码329个氨基酸残基组成的蛋白质。CNN3主要 参与平滑肌的收缩和舒张，具有重要的生物学功能。同时也参与细胞骨架重组所必须 的滋养层细胞的融合，并且在血管内皮细胞骨架重排和迁移中与CNN2扮演相似的角 色。在人类胎盘滋养层分化过程中，CNN3表达量明显降低，表明体内细胞融合后，CNN3 通过降低基因表达或蛋白降解的方式而下调。近来研究表明，CNN3在成肌细胞中也发 挥作用，作用于肌管的形成。随着基因工程技术的广泛应用，CNN3在胚胎发育和生长 的研究也备受关注。到目前，尚未将猪CNN3基因作为仔猪初生重和21日龄断奶重的 分子标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助评价仔猪初生重和断奶重的方法及其专用引物。

本发明提供了用于鉴定待测猪的CNN3基因组中第二内含子自5’末端第182位核 苷酸的多态性（具体可为C/A多态性）或基因型（具体可为CC\CA\AA）的物质在制备 产品中的应用；所述产品的用途为如下（1）至（9）中的至少一种：（1）辅助鉴定待 测猪的初生重；（2）辅助评价待测猪的初生重；（3）辅助比较不同待测猪的初生重； （4）辅助鉴定待测猪的断奶重；（5）辅助评价待测猪的断奶重；（6）辅助比较不同待 测猪的断奶重；（7）辅助检测与猪的初生重和/或断奶重相关的单核苷酸多态性；（8） 鉴定或辅助鉴定猪的初生重和/或断奶重相关的单核苷酸多态性；（9）筛选与猪的初生 重和/或断奶重相关的分子标记。

所述第二内含子可如序列表的序列2所示。

所述断奶重可为21日龄的断奶重。

所述待测猪可为杜长大猪和/或长白猪。

本发明提供的第一种评价待测猪的初生重的方法，包括如下步骤：检测待测猪的CNN3 基因组中第二内含子自5’末端第182位核苷酸，对于所述第182位核苷酸来说，AA基 因型的猪的初生重高于CA基因型的猪，CC基因型的猪的初生重高于CA基因型的猪。

所述方法中，“检测待测猪的CNN3基因组中第二内含子自5’末端第182位核苷 酸”的具体步骤如下：提取待测猪的基因组DNA，用序列表的序列5所示DNA片段和 序列表的序列6所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。

所述第二内含子可如序列表的序列2所示。

所述待测猪可为杜长大猪和/或长白猪。

本发明提供的第一种评价待测猪的断奶重的方法，包括如下步骤：检测待测猪的CNN3 基因组中第二内含子自5’末端第182位核苷酸，对于所述第182位核苷酸来说，CC基 因型的猪的断奶重高于AA基因型的猪，CC基因型的猪的断奶重高于CA基因型的猪。

所述方法中，“检测待测猪的CNN3基因组中第二内含子自5’末端第182位核苷 酸”的具体步骤如下：提取待测猪的基因组DNA，用序列表的序列5所示DNA片段和 序列表的序列6所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。

所述第二内含子可如序列表的序列2所示。

所述断奶重可为21日龄的断奶重。

所述待测猪可为杜长大猪和/或长白猪。

本发明还提供了用于鉴定待测猪的CNN3基因组中第三内含子自5’末端第44位 核苷酸的多态性（具体可为G/T多态性）或基因型（具体可为GG\GT\TT）的物质在制 备产品中的应用；所述产品的用途为如下（1）至（6）中的至少一种：（1）辅助鉴定 待测猪的初生重；（2）辅助评价待测猪的初生重；（3）辅助比较不同待测猪的初生重； （4）辅助检测与猪的初生重相关的单核苷酸多态性；（5）鉴定或辅助鉴定猪的初生重 相关的单核苷酸多态性；（6）筛选与猪的初生重相关的分子标记。

所述第三内含子可如序列表的序列3所示。

所述待测猪可为杜长大猪和/或长白猪。

本发明提供的第二种评价待测猪的初生重的方法，包括如下步骤：检测待测猪的 CNN3基因组中第三内含子自5’末端第44位核苷酸，对于所述第44位核苷酸来说， GT基因型的猪的初生重高于TT基因型的猪。

所述方法中，“检测待测猪的CNN3基因组中第三内含子自5’末端第44位核苷 酸”的具体步骤如下：提取待测猪的基因组DNA，用序列表的序列7所示DNA片段和 序列表的序列8所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。

所述第三内含子可如序列表的序列3所示。

所述待测猪可为杜长大猪和/或长白猪。

本发明还提供了用于鉴定待测猪的CNN3基因组中第四内含子自5’末端第314位 核苷酸的多态性（具体可为G/A多态性）或基因型（具体可为GG\GA\AA）的物质在制 备产品中的应用；所述产品的用途为如下（1）至（9）中的至少一种：（1）辅助鉴定 待测猪的初生重；（2）辅助评价待测猪的初生重；（3）辅助比较不同待测猪的初生重； （4）辅助鉴定待测猪的断奶重；（5）辅助评价待测猪的断奶重；（6）辅助比较不同待 测猪的断奶重；（7）辅助检测与猪的初生重和/或断奶重相关的单核苷酸多态性；（8） 鉴定或辅助鉴定猪的初生重和/或断奶重相关的单核苷酸多态性；（9）筛选与猪的初生 重和/或断奶重相关的分子标记。

所述第四内含子可如序列表的序列4所示。

所述断奶重可为21日龄的断奶重。

所述待测猪可为杜长大猪和/或长白猪。

本发明提供的第三种评价待测猪的初生重的方法，包括如下步骤：检测待测猪的CNN3 基因组中第四内含子自5’末端第314位核苷酸，对于所述第314位核苷酸来说，GA基 因型的猪的初生重低于AA基因型的猪，GA基因型的猪的初生重低于GG基因型的猪。

所述方法中，“检测待测猪的CNN3基因组中第四内含子自5’末端第314位核苷 酸”的具体步骤如下：提取待测猪的基因组DNA，用序列表的序列9所示DNA片段和 序列表的序列10所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。

所述第四内含子可如序列表的序列4所示。

所述待测猪可为杜长大猪和/或长白猪。

本发明提供的第二种评价待测猪的断奶重的方法，包括如下步骤：检测待测猪的CNN3 基因组中第四内含子自5’末端第314位核苷酸，对于所述第314位核苷酸来说，AA基 因型的猪的断奶重高于GG基因型的猪，AA基因型的猪的断奶重高于GA基因型的猪。

所述方法中，“检测待测猪的CNN3基因组中第四内含子自5’末端第314位核苷 酸”的具体步骤如下：提取待测猪的基因组DNA，用序列表的序列9所示DNA片段和 序列表的序列10所示DNA片段组成的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。

所述第四内含子可如序列表的序列4所示。

所述断奶重可为21日龄的断奶重。

所述待测猪可为杜长大猪和/或长白猪。

本发明还保护以上任一所述应用在猪的育种中的应用。

本发明还保护以上任一所述方法在猪的育种中的应用。

本发明还保护一种引物组合物，包括引物对甲、引物对乙和引物对丙中的至少一 对；所述引物对甲为用于扩增含有猪的CNN3基因组中第二内含子自5’末端第182位 核苷酸的DNA分子的引物对；所述引物对乙为用于扩增含有猪的CNN3基因组中第三内 含子自5’末端第44位核苷酸的DNA分子的引物对；所述引物对丙为用于扩增含有猪 的CNN3基因组中第四内含子自5’末端第314位核苷酸的DNA分子的引物对。

所述第二内含子可如序列表的序列2所示。

所述第三内含子可如序列表的序列3所示。

所述第四内含子可如序列表的序列4所示。

所述引物对甲具体可为序列表的序列5所示DNA片段和序列表的序列6所示DNA 片段组成的引物对。

所述引物对乙具体可为序列表的序列7所示DNA片段和序列表的序列8所示DNA 片段组成的引物对。

所述引物对丙具体可为序列表的序列9所示DNA片段和序列表的序列10所示DNA 片段组成的引物对。

所述引物组合物的用途为如下（1）至（9）中的至少一种：（1）辅助鉴定待测猪 的初生重；（2）辅助评价待测猪的初生重；（3）辅助比较不同待测猪的初生重；（4） 辅助鉴定待测猪的断奶重；（5）辅助评价待测猪的断奶重；（6）辅助比较不同待测猪 的断奶重；（7）检测与猪的初生重和/或断奶重相关的单核苷酸多态性；（8）鉴定或辅 助鉴定猪的初生重和/或断奶重相关的单核苷酸多态性；（9）筛选与猪的初生重和/或 断奶重相关的分子标记。

本发明公开了猪CNN3基因组DNA序列中的三个位点的突变，第二内含子C182A、 第三内含子G44T和第四内含子G314A，以及单个SNP位点检测仔猪初生重、21日龄断 奶重的生长性能的技术，为猪的标记辅助育种提供了新的标记。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。猪CNN3基因组如序列表的序列1所示，其中包括序列表的序列2 所示的第二内含子、序列表的序列3所示的第三内含子和序列表的序列4所示的第四 内含子。杜长大猪即杂交三元猪：杜洛克猪×（长白猪×大白猪）。

实施例1、三个SNP位点的发现

用于实施例1的样本为12头长白猪、12头大白猪、10头杜洛克猪、12头通城猪、 12头莱芜黑猪、12头五指山猪和6头荷兰猪。

对各个样本的CNN3基因进行序列比较，将序列比较的结果与各个样本的仔猪初生 重和断奶重性状进行关联分析，发现了三个与仔猪初生重和断奶重性状相关的SNP位 点如下：

C182A：位于猪CNN3基因组的第二内含子中，该SNP位点为序列2所示DNA分子 自5’末端第182位核苷酸，存在两种等位形式，C和A。

G44T：位于猪CNN3基因组的第三内含子中，该SNP位点为序列3所示DNA分子自 5’末端第44位核苷酸，存在两种等位形式，G和T。

G314A：位于猪CNN3基因组的第四内含子中，该SNP位点为序列4所示DNA分子 自5’末端第314位核苷酸，存在两种等位形式，G和A。

实施例2、三个SNP位点的应用

用于实施例2的样本为36头长白猪和181头杜长大猪，均获自北京顺义猪场。

一、C182A的应用

1、取待测猪的耳组织，提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增， 进行琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物。

F1(序列表的序列5)：5’-TCGCAACTGGATAGAAGAGG-3’；

R1（序列表的序列6）：5’-TTCACCTTCTTCACGGAGCC-3’。

PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸 30s，30个循环；72℃延伸10min。

3、将步骤2回收的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果将各个样本的C182A 位点进行基因型分析（即分析PCR扩增产物中，序列2所示第二内含子的第182位核 苷酸是C还是A，从而对应CC、CA和AA三种基因型），并统计基因型频率和等位基因 频率，结果见表1。

表1 C182A位点在待测猪群中的基因型频率及等位基因频率

对于C182A位点来说：在长白猪群体中，CA基因型（杂合型）的频率高于CC 基因型（纯合型）和AA基因型（纯合型），C等位基因为优势基因；在杜长大猪群体 中，也呈现相同的趋势。

4、检测待测猪的初生重和21日龄断奶重，并计算每个基因型的待测猪的初生重 平均值和21日龄断奶重平均值，结果见表2和表3。

表2整个群体中C182A位点的单核苷酸多态性与初生重、21日龄断奶重关联性分析

表3杜长大猪群体中C182A位点的单核苷酸多态性与初生重、21日龄断奶重关联性分析

备注:表2和表3中用不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显 著（P>0.05），数值用最小二乘均值±标准误。

表2的结果表明：C182A位点的单核苷酸多态性对初生重和21日龄断奶重均出现 显著影响；AA基因型和CC基因型初生重高于CA基因型0.1kg左右，差异显著；CC 基因型21日龄断奶重高于AA基因型0.82kg，高于CA基因型0.89kg，差异显著。

表3的结果表明：C182A位点的单核苷酸多态性对初生重和21日龄断奶重均出现 显著影响；AA基因型和CC基因型初生重高于CA基因型0.1kg左右，差异显著；CC 基因型21日龄断奶重高于AA基因型0.88kg左右，高于CA基因型1.01kg，差异显著。

二、G44T的应用

1、取待测猪的耳组织，提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增， 进行琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物。

F2(序列表的序列7)：5’-GCCCGGCTCCGTGAAGAAG-3’；

R2（序列表的序列8）：5’-AGCGTCGTCTGAACCTGGG-3’。

PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸 30s，30个循环；72℃延伸10min。

3、将步骤2回收的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果将各个样本的G44T位 点进行基因型分析（即分析PCR扩增产物中，序列3所示第三内含子的第44位核苷酸 是G还是T，从而对应GG、GT和TT三种基因型），并统计基因型频率和等位基因频率， 结果见表4。

表4G44T位点在待测猪群中的基因型频率及等位基因频率

对于G44T位点来说：在长白猪群体和杜长大猪群体中，TT基因型（纯合型）远 远高于GT基因型（杂合型），两群体中均未检测到GG基因型个体，T等位基因为优势 基因。

4、检测待测猪的初生重和21日龄断奶重，并计算每个基因型的待测猪的初生重 平均值和21日龄断奶重平均值，结果见表5和表6。

表5整个群体中G44T位点的单核苷酸多态性与初生重、21日龄断奶重关联性分析

表6杜长大猪群体中G44T位点的单核苷酸多态性与初生重、21日龄断奶重关联性分析

备注:表5和表6中用不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显 著（P>0.05），数值用最小二乘均值±标准误。

表5的结果表明：G44T位点的单核苷酸多态性对初生重产生显著影响，GT基因型 高于TT基因型0.11kg，差异显著。

表6的结果表明：G44T位点的单核苷酸多态性对初生重产生显著影响，GT基因型 高于TT基因型0.16kg，差异显著。

三、G314A的应用

1、取待测猪的耳组织，提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增， 进行琼脂糖凝胶电泳并回收PCR扩增产物。

F3(序列表的序列9)：5’-ATGACCCAGGTTCAGACGA-3’；

R3（序列表的序列10）：5’-CTTCACTCCAATGTCAATG-3’。

PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸 30s，30个循环；72℃延伸10min。

3、将步骤2回收的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果将各个样本的G314A 位点进行基因型分析（即分析PCR扩增产物中，序列4所示第四内含子的第314位核 苷酸是G还是A，从而对应GG、GA和AA三种基因型），并统计基因型频率和等位基因 频率，结果见表7。

表7G314A位点在待测猪群中的基因型频率及等位基因频率

对于G314A位点来说：GA基因型（杂合型）频率高于AA基因型（纯合型）和GG 基因型（纯合型）；长白猪群体中，等位基因A为优势基因；杜长大猪群体中，等位基 因G为优势基因。

4、检测待测猪的初生重和21日龄断奶重，并计算每个基因型的待测猪的初生重 平均值和21日龄断奶重平均值，结果见表8和表9。

表8整个群体中G314A位点的单核苷酸多态性与初生重、21日龄断奶重关联性分析

表9杜长大猪群体中G314A位点的单核苷酸多态性与初生重、21日龄断奶重关联性分析

备注:表中用不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著 （P＞0.05），数值用最小二乘均值±标准误。

表8的结果表明：G314A位点的单核苷酸多态性对初生和断奶重产生显著影响； GA基因型的初生重显著低于AA基因型和GG基因型，差异显著；AA基因型的21日龄 断奶重高于GG基因型和GA基因型，差异显著。

表9的结果表明：G314A位点的单核苷酸多态性对初生和断奶重产生显著影响； GA基因型的初生重显著低于AA基因型和GG基因型，差异显著；AA基因型的21日龄 断奶重高于GG基因型和GA基因型，差异显著。