植物内芽孢杆菌在抗植物寄生线虫中的应用

摘要

本发明公开了植物内芽孢杆菌在抗植物寄生线虫中的应用。该植物内芽孢杆菌的菌株号为JZB126，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.11846。植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126对南方根结线虫的校正死亡率为99.1％，连续培养4代后，对南方根结线虫的校正死亡率为97.1％，对南方根结线虫卵孵化的平均抑制率为99.0％。在没有任何助剂填加的条件下，45天时对黄瓜根结线虫病防效达80.7％，80天后对黄瓜根结线虫病防效仍达65.1％。植物内芽孢杆菌JZB126和/或其代谢物可用于植物根结线虫的防治中。

说明书

本申请是申请号为201610248625.9、申请日为2016年04月20日、发明创造名称为“一株来源于抗线虫品种的植物内芽孢杆菌及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及植物内芽孢杆菌在抗植物寄生线虫中的应用。

背景技术

根结线虫Meloidogyne spp.是严重危害农业生产的一类土传病原，可以寄生于多种农作物，尤其是蔬菜，在热带和亚热带地区造成了严重减产(Kiewnick S，Sikora RA.2006.Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne incognita byPaecilomyces lilacinus strain 251.Biological Control，38(2)：179-187.)。近年来，随着我国蔬菜种植面积不断扩大，蔬菜根结线虫病的发生逐年加重，已成为严重影响蔬菜产品安全的疑难病害之一(赵志祥等.2010.温室黄瓜根结线虫发生地土壤微生物宏基因组文库的构建及其一个杀线虫蛋白酶基因的筛选.微生物学报，50(8)：1072-1079)。

目前线虫防治仍以化学杀线剂防治为主，由于其对非靶标生物的毒性和对人畜剧毒，严重污染环境和地下水源，而且农药的残留污染直接影响农产品的质量和品质，线虫的危害已成为制约无公害蔬菜生产可持续发展和食品安全保障的突出问题。因此，开发对环境友好、对人、畜无毒的生物杀线虫剂迫在眉睫。

绝大多数植物根结线虫生防菌是从土壤或植物根际土壤微生物中分离筛选得到的，但这些土壤微生物易受外界条件的影响，并难于在与土壤、植物根际或叶围习居微生物的竞争中长期占优势，因而极大地影响了其实用价值。近年来植物内生细菌作为生物防治中的天然资源菌受到越来越多研究者的关注，成为分离获得植物根结线虫生防菌的重要来源(江绪文，李贺勤.2014.植物内生菌防治植物寄生线虫的研究进展.生物技术通报，9：7-10)。

植物内生细菌作为生防因子有很多优点：它们分布于植物的不同组织中，有充足的营养物质，同时受到植物组织的保护，不受外部恶劣环境如强烈日光、紫外线、风雨等的影响，具有稳定的生态环境。因此，内生细菌相对于附生细菌更易于发挥生防作用。由于内生细菌系统地分布于植物体根、茎、叶、花、果实、种子等的细胞或细胞间隙中，它可以直接面对病菌的侵染，对病菌的致病因子或病菌本身发起攻击，降解病菌菌丝或致病因子，产生拮抗物质，或诱导植物产生系统抗性抑制病原物，而植物本身的基因并未发生改变，仍然可以保持植物的天然性状。另外内生菌对寄主植物有促生作用。因此内生细菌是植物病害生物防治的天然资源菌，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景(易有金等.2007.内生细菌在植物病害生物防治中的作用，21(5)：474-477)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何防治植物根结线虫。

为解决以上技术问题，本发明提供了一株植物内芽孢杆菌。

本发明所提供的植物内芽孢杆菌，其菌株号为JZB126，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.11846，以下简称植物内芽孢杆菌JZB126。

上述植物内芽孢杆菌JZB126可以芽孢、菌丝或含有芽孢和/或菌丝的菌丝体的形式存在。

上述植物内芽孢杆菌JZB126的培养物也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的植物内芽孢杆菌JZB126的培养物，是将植物内芽孢杆菌JZB126在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质，所述物质包括所述植物内芽孢杆菌和所述植物内芽孢杆菌的代谢物。

上述植物内芽孢杆菌JZB126的培养物中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。

为解决以上技术问题，本发明提供了植物根结线虫抑制剂。

本发明所提供的植物根结线虫抑制剂，它的活性成分是植物内芽孢杆菌JZB126和/或植物内芽孢杆菌JZB126的代谢物。

上述植物内芽孢杆菌JZB126的代谢物可从所述植物内芽孢杆菌JZB126的发酵液中获得。所述植物内芽孢杆菌JZB126的代谢物具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述植物内芽孢杆菌JZB126，除去液体培养物(发酵液)中的植物内芽孢杆菌JZB126即得到所述植物内芽孢杆菌JZB126的代谢物。

上述植物根结线虫抑制剂中，所述根结线虫可为南方根结线虫。

上述植物内芽孢杆菌JZB126和/或植物内芽孢杆菌JZB126的代谢物和/或植物内芽孢杆菌JZB126的培养物在制备植物根结线虫抑制剂中的应用或在制备抑制植物根结线虫危害黄瓜药剂中的应用也属于本发明的保护范围。

上述植物内芽孢杆菌JZB126和/或植物内芽孢杆菌JZB126的代谢物和/或植物内芽孢杆菌JZB126的培养物在抑制植物根结线虫中的应用或抑制植物根结线虫危害黄瓜中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述根结线虫可为南方根结线虫。

上文中，所述植物根结线虫抑制剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

上述植物根结线虫抑制剂中，植物内芽孢杆菌JZB126可以芽孢、菌丝或含有芽孢和/或菌丝的菌丝体的形式存在。

所述植物根结线虫抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述植物根结线虫抑制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

实验证明，植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126对南方根结线虫的校正死亡率为99.1％，植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126菌株连续培养4代后，对南方根结线虫的校正死亡率为97.1％。植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126对南方根结线虫卵孵化的平均抑制率为99.0％。植物内芽孢杆菌(Bacillusendophyticus)JZB126液体发酵培养物在没有任何助剂填加的条件下，45天时对黄瓜根结线虫病防效达80.7％，80天后对黄瓜根结线虫病防效仍达65.1％。经植物内芽孢杆菌JZB126或植物内芽孢杆菌JZB126的培养物处理后的黄瓜苗根系发达，根结少，植株生长正常，对黄瓜安全。植物内芽孢杆菌JZB126和/或植物内芽孢杆菌JZB126的代谢物可用于植物根结线虫的防治中。

保藏说明

菌种名称：植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)

菌株编号：JZB126

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年12月9日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.11846

附图说明

图1为菌株JZB126在牛肉膏蛋白胨平板上的菌落形态。

图2为菌株JZB126杀根结线虫遗传稳定性

图3为对照组施药45天时黄瓜根系照片。

图4为JZB126处理组施药45天时黄瓜根系照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、植物内芽孢杆菌JZB126的分离与鉴定

1.1菌株分离

2014年11月在北京市顺义区绿奥大棚基地番茄地块，采集抗线虫番茄(品种：荷兰硬粉8号)幼根装入自封袋内，带回实验室处理。称取1g幼根，用75％酒精漂洗30s，无菌水清洗3次，用无菌剪刀将幼根剪碎，放进灭过菌的研钵内并加石英砂进行研磨。将研磨液加入装有9mL无菌水的离心管中，样品浓度为10^-1，摇匀后，依次配成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5梯度稀释液。分别吸取不同梯度稀释液200μL，均匀涂到牛肉膏蛋白胨平板上，每个浓度重复3次。放置于28℃培养箱中培养。2-5d后，根据菌落的颜色、边缘、形状、透明度等挑取单菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线3次，获得纯培养，待长好后，置于冰箱中保存。取编号为JZB126的菌株进行下述鉴定。

1.2菌株鉴定

1.2.1菌株形态观察

①表观鉴定：通过观察菌体的颜色、大小、形态、边缘、透明度、光泽度、培养基的颜色等，并通过革兰氏染色观察个体形态特征。

将JZB126在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线培养，从图1中可以看到：JZB126菌落不规则、灰白色、菌落表面干燥无光泽、无褶皱、表面不透明。镜检发现菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性，有芽孢，上述形态特征表明菌株JZB126属于芽孢杆菌属。

②生理生化测定：采用硝酸盐还原实验、耐盐性培养、明胶液化、淀粉水解实验、柠檬酸钠盐等生理生化实验。

JZB126部分生理生化实验结果如表1。结果表明，细菌菌株JZB126生理生化特征与芽孢杆菌属生理生化特征基本相似。

表1 JZB126部分生理生化实验

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性

③分子鉴定：试剂盒法提取细菌菌株基因组DNA。以提取的DNA为模板，扩增引物为通用引物27F(5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’)和1492R(5’-AAG GAG GTG ATC CAGCCG CA-3’)。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃1min，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，4℃保温。PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后送生工生物工程(北京)有限公司测序。

经测序获得菌株JZB126的16S rDNA序列(序列表中序列1)，通过Blast分析，选取与之同源性较高的菌株，利用软件MEGA5.0进行系统发育分析、Neighbor-Joining法构建菌株的16S rDNA系统发育树。结果表明JZB126与Bacillus endophyticus聚在一个分支上，同源性为99％，结合之前形态特征和生理生化实验，JZB126鉴定为植物内芽孢杆菌。

植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126已于2015年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11846。

实施例2、植物根结线虫抑制剂及其杀线虫活性

1、植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126的培养

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000ml，混匀分装，121℃灭菌20min。将植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线3次，获得单菌落。

2.植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126的杀线虫活性

2.1南方根结线虫卵、卵囊及二龄幼虫的获得

南方根结线虫用感病番茄品种佳粉15号室内盆栽接种方式保存。接种40d后，在番茄根系有大量卵囊出现，将根系用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在0.5％次氯酸钠溶液中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放在盛有少量无菌水的培养皿内，4℃保存备用。

另取部分卵囊放在盛有少量无菌水的培养皿内，25℃培养4d，每隔24h收集一次新孵化的南方根结线虫二龄幼虫，室温保存备用。

将病根洗净，剪成0.5-1cm的小段，放入500mL三角瓶中，加1％次氯酸钠溶液200mL，剧烈震荡5min，用200目及500目网筛反复冲洗收集，通过500目网筛收集到纯净的南方根结线虫卵，4℃保存备用。

2.2植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126对南方根结线虫的活性检测

2.2.1 32孔板法活性检测

实验设如下两个处理：

JZB126处理组：将植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126接于装有20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的50mL三角瓶中，在28℃、220r/min下培养48h收集发酵液，该发酵液中植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126的含量为2×10¹⁰cfu/mL。用0.22μm的水系滤膜过滤发酵液，收集滤液，将滤液加入32孔板培养板的穴孔内，每孔加100μL，加入等体积的南方根结线虫二龄幼虫溶液(200条/mL)，每个处理重复4次。在28℃培养箱中培养24h后，在体视显微镜下观察并记录线虫死亡数，计算校正死亡率。该实验操作在无菌环境下进行。

对照组：用牛肉膏蛋白胨液体培养基替代JZB126处理组中的滤液加入32孔板培养板的穴孔内，每孔加100μL，加入等体积的南方根结线虫二龄幼虫溶液(200条/mL)，每个处理重复4次。在28℃培养箱中培养24h后，在体视显微镜下观察并记录线虫死亡数，计算校正死亡率。该实验操作在无菌环境下进行。

2.2.2菌株遗传稳定性检测

将植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126在牛肉膏蛋白胨培养基平板上连续4次划线继代培养。检测每一代菌株的抗根结线虫活性。计算出每一代菌株杀根结线虫的校正死亡率。方法同2.2.1。

2.2.3对南方根结线虫卵囊孵化的抑制作用

实验设如下两个处理：

JZB126处理组：将植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126接于装有20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的50mL三角瓶中，在28℃、220r/min下培养48h收集发酵液，该发酵液中植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126的含量为2×10¹⁰cfu/mL。用0.22μm的水系滤膜过滤发酵液，收集滤液，将滤液加入24孔板培养板的穴孔内，每孔加900μL；取新鲜饱满的南方根结线虫卵囊，大小基本一致，0.5％次氯酸钠溶液表面消毒2min，无菌水冲洗3次，放入装有待测滤液的穴孔内，每个穴孔放2个卵囊。每个处理重复3次，25℃下孵化。5d后观察统计孵化出的线虫的数量。计算线虫卵孵化的相对抑制率。

对照组：用牛肉膏蛋白胨液体培养基替代JZB126处理组中的滤液加入24孔板培养板的穴孔内，每孔加900μL；取新鲜饱满的南方根结线虫卵囊，大小基本一致，0.5％次氯酸钠溶液表面消毒2min，无菌水冲洗3次，放入装有待测滤液的穴孔内，每个穴孔放2个卵囊。每个处理重复3次，25℃下孵化。5d后观察统计孵化出的线虫的数量。计算线虫卵孵化的相对抑制率。

相对抑制率(％)＝100×(对照组孵化线虫平均数-处理组孵化线虫平均数)÷对照组孵化线虫平均数。

杀线虫活性实验结果：植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126对南方根结线虫的校正死亡率为99.1％，植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126连续培养4代后，对南方根结线虫的校正死亡率为97.1％(图2)。综上分析，植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126具有较强且稳定的杀根结线虫活性。植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126发酵液抑制根结线虫卵孵化实验结果表明，JZB126对南方根结线虫卵孵化的平均抑制率为99.0％(结果见表2)。

表2 JZB126发酵液对根结线虫卵孵化的影响

通过以上两种对南方根结线虫活力和卵囊孵化的抑制作用试验结果表明，植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126是一株极具有应用价值的细菌，特别是对南方根结线虫的杀线虫作用和对其卵囊孵化的抑制作用，显示出其良好的应用开发前景。

2.3温室盆栽防治黄瓜南方根结线虫(Meloidogyne incognita)效果

供试材料和方法：

黄瓜：品种为北京402

线虫：南方根结线虫Meloidogyne incognita

黄瓜育苗于直径13cm、高10cm的营养钵中，育苗土为无线虫园土和沙土按1:4比例混合。出苗后间苗每个营养钵留1株。

JZB126液体发酵培养：发酵培养基为LB液体培养基(溶剂为水，溶质及其浓度为胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，调pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min)。挑取JZB126单菌落接种到装有100mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，30℃，摇床转速200r·min^-1～220r·min^-1、发酵48h，得到植物内芽孢杆菌(Bacillus>10cfu/mL。

实验设如下两个处理：

JZB126处理组：等黄瓜苗长出4-5片真叶后接种南方根结线虫：将培养好的南方根结线虫配制成100条/mL的线虫悬浮液，在植株根周围均匀的插3个小孔，将线虫悬浮液滴入小孔中，每营养钵接种1500条南方根结线虫。当天进行药剂处理，植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126发酵液用量与营养钵里的土比例是1/5(液体量质量/土样重量)。实验设3次重复，每次重复处理10株黄瓜。然后放置在温室中进行培养。培养10天后用植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126发酵液再处理一次(用量同上次)，正常田间管理，在施药后45天和80天调查根结数。根据根结数确定防治效果。

对照组：将植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126发酵液替换为等量的清水，其它实验操作与JZB126处理组相同。

表3植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126发酵液温室盆栽试验结果

结果表明，植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126液体发酵培养物在没有任何助剂填加的条件下，施用2次，45天时对黄瓜根结线虫病防效达80％以上，80天后对黄瓜根结线虫病防效仍达65％以上(表3)。经植物内芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)JZB126处理后的黄瓜苗根系发达，根结少，植株生长正常，未发现明显的药害(图3和图4)，对黄瓜安全，具有良好的应用价值，该浓度已经达到产业化开发利用的浓度要求。

<110> 北京市农林科学院

<120> 植物内芽孢杆菌在抗植物寄生线虫中的应用

<130> CGGNAFH 190636

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 植物内芽孢杆菌（Bacillus endophyticus）

<400> 1

tgctatacat gcagtcgagc ggagatttga aagcttgctt ttcaaatctt agcggcggac 60

gggtgagtaa cacgtgggca acctgccctt gagacgggga taactccggg aaaccggagc 120

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