一株防病促生的非洲哈茨木霉及其应用

摘要

本发明公开了一株防病促生的非洲哈茨木霉及其应用。该非洲哈茨木霉的菌株号为TM2‑4，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.15881。非洲哈茨木霉M2‑4对果蔬作物上的番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、辣椒炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌均具有抑制作用；对番茄灰霉病具有良好的离体防效，对番茄种子发芽和植株生长具有促进作用。非洲哈茨木霉TM2‑4具有产吲哚乙酸(IAA)活性、产嗜铁素活性、具有产葡聚糖酶和几丁质酶活性。非洲哈茨木霉TM2‑4繁殖速度快，能够人工培养，培养条件简单，在麸皮玉米芯营养液固态发酵培养基上产孢量最高可达3.2×109cfu/g固态菌剂。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域中一株防病促生的非洲哈茨木霉及其应用。

背景技术

番茄灰霉病的病原菌是半知菌亚门葡萄孢属的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。灰霉病病菌的寄主范围较广，不仅会侵染番茄、黄瓜、茄子、辣椒、莴苣、甘蓝、洋葱、菜豆等蔬菜，还会侵染苹果、草莓、柑橘、葡萄等果树。

真菌病害频发是影响设施园艺果蔬作物产业发展的主要因素之一。目前针对果蔬灰霉病病害防治除选育优良抗病品种、加强作物栽培管理外，主要采用喷施化学药剂的措施。长期大规模使用化学药剂存在生态环境污染、生物多样性锐减及病原菌抗药性等系列问题。

目前，用于植物病害生物防治的生防因子很多，包括拮抗微生物、抗生素和植物诱导因子等，其中拮抗微生物种类主要有细菌、真菌和放线菌。采用拮抗微生物对果蔬病害进行生物防治具有环境友好、生态安全、病原菌不易产生抗性等优点。筛选具有拮抗灰霉病菌活性的微生物，开发可逐步替代化学农药的新型微生物农药产品对于果蔬作物灰霉病绿色防控具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何抑制果蔬作物真菌病害并促进果蔬作物生长。

为解决以上技术问题，本发明提供了一株非洲哈茨木霉，该菌株生长迅速、产孢量大，对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)等多种植物病原真菌有抑制作用；该菌株能够产生吲哚乙酸、嗜铁素、葡聚糖酶、几丁质酶等生防活性物质。

本发明所提供的非洲哈茨木霉，是非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)，其菌株号为TM2-4，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.15881。下文简称非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4。

非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4具有序列表中序列1所示的rDNA-ITS序列，序列表中序列2所示的转录延伸因子(tef1-α)基因序列和序列表中序列3所示的RNA聚合酶II的第2亚基(rpb2)基因序列。

非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物，是将非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质。

上述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物中，所述物质包括所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4和所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的代谢物。

上述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。

上述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物中，所述固体培养基可为固态发酵培养基。所述固态发酵培养基可由以下质量份的物质组成：麸皮7-10份，玉米芯0-3份和水或营养液5-7份。

上述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物中，所述营养液由溶质和溶剂组成，溶质及其质量浓度可为：葡萄糖1％-2.5％，(NH₄)₂SO₄>2PO₄>4>

上述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物中，所述溶质及其质量浓度具体可为葡萄糖2％，(NH₄)₂SO₄>2PO₄>40.5％。

上述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物中，所述固态发酵培养基具体可由以下质量份的物质组成：麸皮7份，玉米芯3份和营养液6份。

上述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物中，所述培养可为在25-28℃，空气相对湿度为90-95％的条件下，培养7-10d。

为解决以上技术问题，本发明提供了菌剂。

本发明所提供的菌剂含有非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的代谢物和/或非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物。

上述菌剂中，所述菌剂可为病原菌抑制剂、病害抑制剂、产生生长素IAA的菌剂、促进植物生长的菌剂、促进植物种子萌发的菌剂、产生几丁质酶的菌剂、产生嗜铁素的菌剂或产生葡聚糖酶的菌剂。

上述菌剂中，所述病原菌抑制剂可对下述至少一种病原菌具有抑制作用：

A、番茄灰霉病菌；

B、桃褐腐病菌；

C、辣椒炭疽病菌；

D、黄瓜枯萎病菌；

所述病害可为下述至少一种：

a、番茄灰霉病；

b、桃褐腐病；

c、辣椒炭疽病；

d、黄瓜枯萎病。

上述菌剂中，所述菌剂的活性成分可为非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的代谢物和/或所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物，所述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，所述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据抑菌效果、抗病效果、产生生长素IAA效果、促进植物生长效果、促进植物种子萌发的效果、产生几丁质酶的效果、产生嗜铁素的效果或产生葡聚糖酶的效果确定。

上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。

上述菌剂中，所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4可以孢子、菌丝或含有孢子和/或菌丝的培养物的形式存在。

上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

本发明所提供的病原菌抑制剂含有非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的代谢物、和/或所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物。

上述菌剂中，所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的代谢物可从所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的发酵液中获得。

所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的代谢物可为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的无菌代谢物或非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4的含菌代谢物。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4得到液体培养物(发酵液)，过滤除去液体培养物中的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4即得到非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4的无菌代谢物。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4，收集培养容器内的所有物质(发酵液)，该发酵液即为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物。

上述菌剂中，所述液体培养基可为PD液体培养基。

非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4、非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4的代谢物、和/或所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在抑制病害中的应用；

4)在制备病害抑制剂中的应用。

非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4、非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4的代谢物、所述非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的培养物和/或所述菌剂的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：

A1)在制备产生生长素IAA的产品中的应用；

A2)在制备生长素IAA中的应用；

A3)在制备促进植物生长的产品中的应用；

A4)在促进植物生长中的应用；

A5)在制备产生葡聚糖酶的产品中的应用；

A6)在制备葡聚糖酶中的应用；

A7)在制备产生几丁质酶的产品中的应用；

A8)在制备几丁质酶中的应用；

A9)在制备产生嗜铁素的产品中的应用；

A10)在制备嗜铁素中的应用；

A11)在制备促进植物种子萌发的产品中的应用；

A12)在促进植物种子萌发中的应用。

上文中，所述促进种子萌发可为促进植物种子胚轴和/或胚根生长；所述促进植物生长可为增加植物株高、增加植物的植株重量、促进植物根系生长和/或促进植物真叶生长。

上文中，所述植物可为下述任一种植物：

P1)番茄；

P2)番茄属植物；

P3)茄科植物。

本申请中，所述番茄灰霉病菌可为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、所述桃褐腐病菌可为核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)、所述辣椒炭疽病菌可为辣椒刺盘孢(Colletotrichum capsici)、所述黄瓜枯萎病菌可为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum)。

本发明以果蔬病害病原真菌为靶标，通过对特殊生境中的微生物资源进行筛选，获得一株兼具防病促生作用的微生物菌种-非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4，为制备微生物农药新产品提供新资源。非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4对果蔬作物上的番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)和黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)均具有抑制作用；非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4对番茄灰霉病具有良好的离体防效：非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzinum)TM2-4无菌发酵滤液喷施处理番茄离体叶片能够明显降低番茄灰霉病病斑直径，对番茄灰霉病的离体防效为56.8％。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzinum)TM2-4对番茄种子发芽和植株生长具有促进作用：与对照相比，非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液100倍稀释液处理，番茄种子胚轴、胚根长度较对照增加28.7％和19.4％，种子活力指数增加62.1％。非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4含菌代谢物处理番茄植株，其植株总长度、总鲜重、真叶数较对照分别增加9.9％、11.6％和25.6％。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzinum)TM2-4具有产吲哚乙酸(IAA)活性，在含有色氨酸的King液体培养基中IAA含量为28.2μg/ml。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzinum)TM2-4具有产嗜铁素活性，在去铁查氏培养基中嗜铁素活性为63.2％，其As/Ar值分别为0.37(小于0.5)，说明该菌株产嗜铁素能力较高。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzinum)TM2-4具有产葡聚糖酶和几丁质酶活性，培养5d时检测酶活分别为11.75U/ml和12.67U/ml。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4繁殖速度快，能够人工培养，培养条件简单，在麸皮玉米芯营养液固态发酵培养基上产孢量最高达3.2×10⁹cfu/g固态菌剂，适于批量化生产。

保藏说明

菌种名称：非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)

菌株编号：TM2-4

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年6月19日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15881

附图说明

图1为菌株TM2-4菌落形态(a、b)、分生孢子梗(c、d)及分生孢子(e、f)显微形态(×40)。

图2为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4对供试病原真菌的抑制或重寄生作用。

图中，FQHM：番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)，THF：桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)，HGKW：黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)，LJTJ：辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)。上排为TM2-4与病原真菌对峙处理，下排为病原真菌对照。

图3为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液对番茄叶片灰霉病的离体防效。a：未接种液体培养基喷施+灰霉病菌处理，b：菌株TM2-4无菌发酵滤液喷施+灰霉病菌处理，c：50％咯菌腈1000倍液喷施+灰霉病菌处理。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的病原真菌公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得，以重复本申请实验：番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum)(王俊丽等.一株芽胞杆菌QD-10的鉴定及生防特性分析.中国生物防治学报,2014,30(4):564-572.)。

实施例1、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的分离与鉴定

1.1菌株分离

该菌株从中国湖南武陵源原始森林特殊生境土样中分离获得。菌株采用稀释平板法分离，具体操作方法如下：称取土样10g放入90ml无菌水中振荡均匀即为10^-1浓度的菌液，用1ml无菌移液管吸取1ml>-1浓度的菌液于一管9ml无菌水中，摇匀即为10^-2浓度的菌液，同样方法，依次稀释到10^-4。将上述10^-2、10^-3和10^-4土壤菌液分别涂布到PDA平板上，吹干后倒置于25℃培养箱中培养3-5d。挑取形态似木霉菌的单菌落转接到TSM平板上进行纯化培养，镜检初步认定为木霉菌后编号并转接到PDA斜面上培养，待长好后，置于冰箱中保存。取编号为TM2-4的菌株进行下述鉴定。

1.2菌株鉴定

1.2.1菌株形态观察

将菌株TM2-4接种于PDA培养基上，25℃培养观察其菌落形态，光学显微镜下观察分生孢子梗、瓶梗、分生孢子。结果表明菌株TM2-4在PDA培养基上生长迅速，3d菌落直径达9cm，气生菌丝白色，致密绒状，蛛丝状至羊毛状，菌落成熟时暗绿色,菌落背面初为无色，后成黄褐色；4d时开始产孢，分生孢子绿色(图1中a，b)。40倍显微镜下菌株TM2-4菌丝透明，具分枝，有隔；分生孢子梗呈树状分枝规则，初级分枝几乎呈直角或者稍微向顶方向弯曲，呈现对称分布，似金字塔形状。分支上可产生多轮的产孢瓶体，瓶梗安瓿形或瓶形，基部变细，中间膨大，多数为3.5-7.5*2.5-3.8μm，尖端生分生孢子(图1中c，d)。分生孢子球形或近球形，多数为1.5-3.0*1.3-2.8μm(图1中e，f)。

其中，马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，琼脂17g，蒸馏水定容到1000mL，煮沸混匀，121℃条件下灭菌20min，得到PDA培养基。

木霉菌半选择性培养基培养基(TSM培养基)：MgSO₄·7H₂O>2HPO₄>4NO₃>

1.2.2菌株分子生物学鉴定

挑取菌株TM2-4的菌丝体接种到PDA培养基上，25℃培养4d后收集菌丝体，CTAB法提取菌株TM2-4的基因组DNA。采用通用引物ITS1/ITS4扩增其rDNA-ITS区基因序列，采用特殊引物EF1-728F/tef1R扩增其翻译延伸因子(tef1-α)基因序列，采用特殊引物RPB2-210up/RPB2-1450low扩增其RNA聚合酶II的第2亚基(rpb2)基因序列。

测序结果采用Blast软件在NCBI中进行相似性搜索。经测序获得菌株TM2-4的rDNA-ITS序列(序列表中序列1)、翻译延伸因子(tef1-α)基因序列(序列表中序列2)和RNA聚合酶II第2亚基(rpb2)基因序列(序列表中序列3)。根据rDNA-ITS序列分析结果，菌株TM2-4与Trichoderma afroharzianum(KX357849)、Trichoderma harzinum(MF780869)等相似性均达到99％，因此将其归为木霉属(Trichoderma sp.)。根据翻译延伸因子测序和系统发育分析结果，菌株TM2-4与Trichoderma afroharzianum菌株(KR911897、KR051476、FJ463302、KT279008)相似性达99％。根据RNA聚合酶II第2亚基测序和系统发育分析结果，菌株TM2-4与Trichoderma afroharzianum菌株(KP009149、KP009148、KP009145)相似性达99％。

根据《真菌鉴定手册》、《木霉分类与鉴定》等方法初步鉴定该菌株为木霉属(Trichoderma sp.)，利用分子生物学技术对其rDNA-ITS序列、tef1-α和rpb2基因进行扩增测序和系统发育分析后将菌株TM2-4鉴定为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)。

非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4已于2018年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15881。下文简称非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4或菌株TM2-4。

实施例2、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4对供试病原真菌的抑制或重寄生作用

挑取平板上生长好的直径为7mm的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4菌饼和供试病原真菌菌饼，分别对称接种至PDA培养基上距中心2cm的位置，对照不接种非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4菌饼，只接种供试病原真菌菌饼，每个处理三次重复，25℃培养4d观察病原真菌生长情况。供试病原真菌包括：番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)。

对峙培养条件下，非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4能够不同程度抑制并覆盖在番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum)等植物病原真菌菌丝生长。表明该菌株对供试病原真菌生长均有抑制作用。对峙培养过程中，非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4生长迅速，能有效地竞争有限的空间和营养，覆盖靶标病原真菌菌落，产生大量的分生孢子(图2)。

实施例3、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4对番茄灰霉病离体防效

3.1非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液的制备

接种环挑取平板上生长好的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4接种到装有100mL液体发酵培养基的300mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养2d得到种子液，按5％的接种量将种子液转接到装有100mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡发酵培养7d，收集发酵液。将该发酵液12000rpm离心10min取上清液，采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液。该非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液即为病害抑制剂或病原菌抑制剂。

其中，液体发酵培养基为PD液体培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1000mL，121℃条件下灭菌20min。

3.2对番茄灰霉病的离体防效

在温室育苗盘中进行番茄常规化播种育苗，番茄品种为佳粉16。选取大小一致的番茄叶片，2％(w/v)次氯酸钠消毒3min，无菌水冲洗干净。

试验设3组处理，每组处理30片叶片，包括菌株TM2-4无菌发酵滤液喷施+灰霉病菌处理，未接种液体培养基喷施+灰霉病菌处理，50％咯菌腈1000倍液喷施+灰霉病菌处理。

3.2.1菌株TM2-4无菌发酵滤液喷施+灰霉病菌处理：用3.1的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液对番茄叶片进行喷施处理，直到布满叶片，24h后采用灭菌打孔器切取直径7mm的番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)菌饼接种于处理叶片中央。

3.2.2未接种液体培养基喷施+灰霉病菌处理：用3.1的液体发酵培养基(无菌)替换3.2.1非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液，其它操作同步骤3.2.1。作为空白对照。

3.2.3 50％咯菌腈1000倍液喷施+灰霉病菌处理：用50％咯菌腈1000倍液替换3.2.1非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液，其它操作同步骤3.2.1。作为化学药剂对照。

7d后调查灰霉病发病率和发病严重程度，灰霉病发病严重程度按照病斑面积占叶片总面积百分比划分：0＝无病斑症状，1＝病斑面积占叶片总面积的百分比大于0小于等于5％,2＝病斑面积占叶片总面积的百分比大于5％小于等于20％,3＝病斑面积占叶片总面积的百分比大于20％小于等于40％,4＝病斑面积占叶片总面积的百分比大于40％小于等于100％。病情指数(DI)＝[100×Σ(各级病叶数×各级代表值)]/(总叶数×最高级代表值)。根据公式：防效％＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100％，计算对番茄灰霉病的离体防效。

结果表明，供试非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4喷施处理番茄离体叶片能够明显降低番茄灰霉病发病率和病情指数，对番茄灰霉病的离体防效达到56.8％(表1，图3)。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液对番茄灰霉病的防效是50％咯菌腈1000倍液的77.8％。

表1.对番茄叶片灰霉病的离体防效

处理发病率(％)病情指数生防效果(％)未接种液体培养基喷施+灰霉病菌处理100.0±0.061.67±7.64-菌株TM2-4无菌发酵滤液喷施+灰霉病菌处理56.7±5.826.67±2.8956.850％咯菌腈1000倍液喷施+灰霉病菌喷施处理33.3±5.816.67±5.7773.0

实施例4、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4产植物生长素IAA能力测定

采用灭菌的打孔器从培养5d的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4平板上打取直径7mm的菌饼，接种5个上述菌饼于装有100mL King液体培养基300mL三角瓶中，28℃条件下180rpm摇床振荡培养2d，得到种子液，按5％的接种量将种子液转接到装有100mL King液体培养基的500mL三角瓶中，28℃、180rpm摇床振荡培养5d，获得的培养液12000rpm离心10min，取2ml上清液与2ml的PC比色液混匀静置30min，以未接种King液体培养基为阴性对照，测定反应液在530nm下的吸光值。以IAA系列标准液与PC液反应后在530nm下的吸光值制定标准曲线，根据标准曲线计算上清液中的IAA含量。

其中，King液体培养基为：MgSO₄>2HPO₄>

PC比色液为：FeCl₃>

结果表明非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4在King液体培养基中产生吲哚乙酸(IAA)，在King液体培养基中IAA产量为28.2μg/ml。

实施例5、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液(无菌代谢物)促进种子发芽

5.1非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液及其稀释液制备

采用灭菌的打孔器从培养5d的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4平板上打取直径7mm的菌饼，接种5个上述菌饼于装有100mL液体发酵培养基的300mL三角瓶中，28℃条件下180rpm摇床振荡培养2d，得到种子液，按5％的接种量将种子液转接到装有100mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中，28℃摇床180rpm振荡培养7d，收集发酵液。将该发酵液12000rpm离心10min取上清液，采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液。

将非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液分别用无菌水稀释10倍、100倍、200倍、500倍，得到非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液10倍稀释液、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液100倍稀释液、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液200倍稀释液和非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液500倍稀释液。

其中，液体发酵培养基为PD液体培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1000mL，121℃条件下灭菌20min。

5.2种子发芽试验

选取颗粒饱满、大小一致的番茄种子(佳粉16)，采用非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液10倍稀释液、100倍稀释液、200倍稀释液和500倍稀释液浸泡种子，用等体积的步骤1的无菌液体发酵培养基作为对照(CK)。28℃培养24h后收集种子，无菌水冲洗干净，将其放在铺有两层无菌水浸湿滤纸的培养皿中，28℃保湿培养7d，统计发芽率，测量胚轴、胚根长度。每个处理设三次重复，每次重复设10粒种子。

实验结果表明，非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液10倍稀释液降低了番茄种子的发芽率、胚轴胚根长度和种子活力指数；非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液100倍稀释液处理的番茄种子的发芽率与对照相同，番茄种子胚轴、胚根长度较对照增加28.7％和19.4％，种子活力指数增加62.1％。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液200倍稀释液处理的番茄种子，显著增加了番茄胚轴胚根长度和活力指数，增幅分别达26.1％、30.9％和73.3％(表2)。说明非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4在适宜的稀释倍数下对番茄种子发芽具有促进作用。

表2.非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液对番茄种子发芽的影响

注：TM2-4表示非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4无菌发酵滤液处理；CK表示无菌液体发酵培养基处理。

实施例6、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物促进植株生长

6.1非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4含菌代谢物制备

采用灭菌的打孔器从培养5d的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4平板上打取直径7mm的菌饼，接种5个上述菌饼于装有100mL液体发酵培养基的300mL三角瓶中，28℃条件下180rpm摇床振荡培养2d，得到种子液，按5％的接种量将种子液转接到装有100mL液体发酵培养基的500mL三角瓶中，28℃摇床180rpm振荡培养7d，收集发酵液(含有非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4及其代谢物)即为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物。

其中，液体发酵培养基为PD液体培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1000mL，121℃条件下灭菌20min，得到PD液体发酵培养基。

6.2番茄植株栽培

在温室育苗盘中进行番茄常规化播种育苗，选用番茄品种为佳粉16。待番茄植株长至两叶一心期，采用步骤1的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物(含有菌丝体、分生孢子及其代谢物)进行蘸根处理，将番茄植株放置在含200ml步骤1的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物的烧杯中20min，然后移栽至盆。用等体积的步骤1的无菌液体发酵培养基作为对照(CK)。于番茄植株生长30d调查株高、根长，鲜重，真叶数等生物学指标。每个处理设三次重复，每次重复10株幼苗。

结果表明，非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物提高了番茄的株高，增加了番茄植株的鲜重，促进了番茄真叶的生长，其中番茄植株总长度、总鲜重、真叶数较对照分别增加9.9％、11.6％和25.6％(表3)。

表3.非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物对番茄植株生长的影响

注：TM2-4表示非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含菌代谢物处理；CK表示无菌液体发酵培养基即PD液体培养基处理。

实施例7、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4产生物活性物质(1)产嗜铁素活性

将非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4接种于装有100mL去铁查氏液体培养基的300mL三角瓶中，28℃条件下180rpm摇床振荡培养5d。获得的培养液8000rpm离心10min，取200μL上清液与200μL CAS染液混匀静置30min，以去离子水为空白对照调零，测定反应液在680nm下的吸光值(As)。以未接种去铁查氏培养基与CAS染液反应后在680nm下的吸光值作为参比值(Ar)，嗜铁素浓度用嗜铁素活性单位(Siderophore unit，SU)表示，SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％，SU值与嗜铁素活性正相关，且一般产嗜铁素能力较高的微生物As/Ar低于0.5。

其中，去铁查氏液体培养为：NaNO₃>2HPO₄>4>

(2)产葡聚糖酶活性

将非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4接种于装有100mL液体葡聚糖酶诱导培养基的300mL三角瓶中，28℃条件下180rpm摇床培养5d。收集发酵液，8000rpm离心10min，获得上清液，取1mL上清液与1mL昆布多糖溶液(1mg/mL)40℃水浴反应30min,沸水浴10min终止反应。以沸水浴10min灭活的发酵液上清液作为对照。反应产物冷却后采用DNS法测定葡聚糖酶活性：昆布多糖在葡聚糖酶的作用下释放出的还原性糖与DNS发生反应，生成的棕红色物质在550nm处有最大吸收峰，用紫外/可见分光光度计测定其在550nm处的吸光光度值。以葡萄糖系列标准液与DNS反应后在550nm下的吸光值制定标准曲线，根据标准曲线计算菌株TM2-4产葡聚糖酶活性。葡聚糖酶活性定义为在测定条件下，1mL发酵液半小时释放1μg葡萄糖作为1个酶活单位(U)。

其中，液体葡聚糖酶诱导培养基为：茯苓粉4g，酵母提取物5g，KH₂PO₄>2HPO₄1g，MgSO₄>

(3)产几丁质酶活性

将非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4接种于装有100mL液体几丁质酶诱导培养基的300mL三角瓶中，28℃条件下180rpm摇床培养5d,收集发酵液，8000rpm离心10min，获得上清液，取1mL上清液与1mL胶态几丁质溶液(10mg/mL)40℃水浴反应30min,沸水浴10min终止反应。以沸水浴10min灭活的发酵液上清液作为对照。反应产物冷却后采用DNS法测定几丁质酶活性：胶态几丁质在几丁质酶的作用下释放出的还原性糖与DNS发生反应，生成的棕红色物质在550nm处有最大吸收峰。用紫外/可见分光光度计测定其在550nm处的吸光光度值。以葡萄糖系列标准液与DNS反应后在550nm下的吸光值制定标准曲线，根据标准曲线计算菌株TM2-4产几丁质酶活性。几丁质酶活性定义为在测定条件下，1mL发酵液半小时释放1μg N-乙酰氨基葡萄糖作为1个酶活单位(U)。

其中，液体几丁质酶诱导培养基为：胶体几丁质5g，NaNO₃>4>2PO₄>4>

结果表明，非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4具有产嗜铁素活性，在去铁查氏培养基中嗜铁素活性为63.2％，其As/Ar值分别为0.37(小于0.5)，说明该菌株产嗜铁素能力较高。非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4具有产葡聚糖酶和几丁质酶活性，培养5d时检测酶活分别为11.75U/ml和12.67U/ml。

实施例8、非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4固态菌剂制备

(1)平板培养

将活化好的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4接种到PDA平板上28℃培养5-7d待其产孢。

(2)摇瓶培养

无菌水冲洗制备孢子悬浮液，并调整孢子浓度为10⁶个孢子/ml。将孢子悬浮液按照3％的比例接种于装有100mL种子培养基的300mL三角瓶中，28℃条件下180rpm摇床振荡培养2d即得种子液。所述种子培养基为马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基。其中，马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4层纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1000mL，121℃条件下灭菌20min，得到PD液体发酵培养基。

(3)固态发酵

将种子液按照5％(体积含量)的接种量接入装有100g固态发酵培养基(厚度约3-4cm)的500mL烧杯中，六层纱布覆盖后28℃、空气相对湿度控制在90-95％的条件下静置培养7d即得固态发酵产物。获得的非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4固态发酵产物室温风干后粉碎即得非洲哈茨木霉固态制剂，采用血球计数板结合稀释平板法测定菌剂非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4的含孢量。

其中，固态发酵培养基主要原料为麸皮和/或玉米芯，固态培养基含水量为60％，121℃灭菌30min。本实施例具体采用了如下固态发酵培养基1、固态发酵培养基2、固态发酵培养基3和固态发酵培养基4：

固态发酵培养基1由以下质量份的物质组成：麸皮7份，玉米芯3份，营养液6份。其中营养液由溶质和溶剂组成，溶质及其质量浓度为：葡萄糖2％，(NH₄)₂SO₄>2PO₄>4>

固态发酵培养基2由以下质量份的物质组成：麸皮7份，玉米芯3份，水6份。配好后分装至500mL烧杯灭菌，每个烧杯装量约为100g(厚度约3-4cm)，灭菌条件为121℃30min。

固态发酵培养基3由以下质量份的物质组成：麸皮10份，营养液6份。其中营养液由溶质和溶剂组成，溶质及其质量浓度为：葡萄糖2％，(NH₄)₂SO₄>2PO₄0.25％，MgSO₄>

固态发酵培养基4由以下质量份的物质组成：麸皮10份，水6份。配好后分装至500mL烧杯灭菌，每个烧杯装量约为100g(厚度约3-4cm)，灭菌条件为121℃30min。

结果表明，非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4在固态发酵培养基1中产孢量最高，培养7天产孢量最高达3.2×10⁹cfu/g固态菌剂。

表4.非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)TM2-4在不同固态发酵培养基上产孢量

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 北京市农林科学院

<120> 一株防病促生的非洲哈茨木霉及其应用

<130> GNCFH181867

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> 非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）

<400> 1

atcgagctta cactcccaac ccaatgtgaa cgttaccaaa ctgttgcctc ggcgggatct 60

ctgccccggg tgcgtcgcag ccccggacca aggcgcccgc cggaggacca accaaaactc 120

ttattgtata ccccctcgcg ggtttttttt ataatctgag ccttctcggc gcctctcgta 180

ggcgtttcga aaatgaatca aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga 240

agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct 300

ttgaacgcac attgcgcccg ccagtattct ggcgggcatg cctgtccgag cgtcatttca 360

accctcgaac ccctccgggg ggtcggcgtt ggggatcggc cctgccttgg cggtggccgt 420

ctccgaaata cagtggcggt ctcgccgcag cctctcctgc gcagtagttt gcacactcgc 480

atcgggagcg cggcgcgtcc acagccgtta aacacccaac ttctgaaatg ttgacctcgg 540

atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc atatcaataa gc 582

<210> 2

<211> 599

<212> DNA

<213> 非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）

<400> 2

acggaattcg gctcgattct tcctcctcca cattcaattg tgcccgacaa ttctgcagag 60

aattttcgtg tcgacaattt ttcatcaccc cgctttccat tacccctcct ttgcagcgac 120

gcaaattttt tttgctgtcg tttggttttt agtggggttc tctgtgcaac cccactagct 180

ccctgctttt tcctgcttca ccttcacttc ctcgtcatca ttcaacgtgc tctgcgtctt 240

tggtcattca gcgacgctaa ccacttttcc atcaatagga agccgccgaa ctcggcaagg 300

gttccttcaa gtacgcttgg gttcttgaca agctcaaggc cgagcgtgag cgtggtatca 360

ccattgacat tgctctgtgg aagttcgaga ctcccaagta ctatgtcacc gtcattggta 420

agtcttcact aagttcatgc tgcaattgcg gaccagtgct aacaggcaat tcacagacgc 480

tcccggccac cgtgatttca tcaagaacat gatcactggt acttcccagg ccgattgcgc 540

tatcctcatc attgccgccg gtactggtga gttcgaggct ggtatctcaa ggggatggc 599

<210> 3

<211> 1086

<212> DNA

<213> 非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）

<400> 3

gtttgcttcg accttgtcac atttgcgtcg taccacactc ctatcgggag agatggtaag 60

ctggcgaagc ctcgacagct tcacaacacg cattggggct tggtctgccc agccgagaca 120

cccgaaggac aggcctgtgg tctggtcaag aacttgtctt tgatgtgtta cgtcagtgtc 180

ggttctccct ccgagcctct gattgagttc atgatcaaca gaggtatgga agtcgtcgaa 240

gagtacgagc cgctgcggta tcctcatgct acaaagattt ttgtgaacgg tgtctgggtt 300

ggagttcacc aagaccctaa gcacttggtg aaccaggttc tggatactcg tcgcaagtcc 360

tatctgcaat acgaagtctc tctcgtgaga gaaattcgag accaggaatt caaaatcttt 420

tccgatgcag gtcgtgtcat gcgaccagtc tttaccgttc agcaggaaga tgatccggaa 480

acgggcatca acaagggcca cctggtattg accaaggagc tcgtcaatag attggccaag 540

gagcaggctg agcctccgga agaccccagc atgaagattg gatgggaggg attgatcagg 600

gctggtgcgg ttgaatatct cgacgccgag gaagaggaga cggccatgat ctgcatgaca 660

ccagaggatc tcgagctgta tcgtcttcag aaggccggta tcaacactga ggaagacatg 720

ggagatgatc cgaacaagcg actcaagacc aagacgaacc cgacaactca catgtacacc 780

cattgcgaga ttcacccaag tatgatctta ggtatctgtg ctagtatcat tcctttcccc 840

gatcacaacc aggtatgttg tccacgcttt cagtcttatg aacgaagaaa aaaactaatg 900

gtgtgcatag tccccccgta acacttacca atctgccatg ggtaagcaag ctatgggttt 960

cttcctcacg aattattctc ggcgcatgga caccatggcc aatatccttt actaccccca 1020

gaagccgctg ggtaccactc gatccatgga gttttgaaat tccgagagtt gcctgctggt 1080

cagaac 1086