降低球等鞭金藻贴壁及提高生长量的方法

摘要

本发明属于藻类技术领域，公开了降低球等鞭金藻贴壁及提高生长量的方法，其包括如下步骤：将球等鞭金藻种子液按照5‑10%的接种量接种到含有培养液的反应池中，然后添加100‑200mg/L的氨基酸，20‑22℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.4‑0.5vvm；培养48‑72h，收集藻细胞。本发明方法可以明显降低球等鞭金藻的贴壁现象，提高藻细胞生物量。

说明书

技术领域

本发明属于藻类技术领域，具体涉及降低球等鞭金藻贴壁及提高生长量的方法。

背景技术

球等鞭金藻是一种单细胞微藻，属普林藻纲等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭藻属，藻体为单细胞或集成群体，附着生长，呈金褐色，除含叶绿素外，尚含有较多的类胡萝卜素，营光合自养，培养方式简单，成本低廉，增殖速率快，细胞内含有丰富的不饱和脂肪酸。

现有的研究大多集中在如何提高藻细胞的不饱和脂肪酸产量的研究中，例如，中国发明专利“CN201410597451”公开了一种提高金藻中DHA含量的方法，包括往培养液中添加一定量的甘油，DHA产量可以提高，同时提高了其他脂肪酸的含量。对球等鞭金藻的前期生长状况研究较少，申请人在之前的研究成果“提高球等鞭金藻生物量以及DHA产量的方法”等相关项目已经申报国家发明专利，其中，在前期的培养过程中通过添加萘乙酸钠和赤霉素，可以提高球等鞭金藻的分裂速率，后期通过添加一定浓度的花生四烯酸和没食子酸丙酯，提高了DHA产量。

目前，球等鞭金藻最主要的方式是规模化人工培养。然而，在球等鞭金藻的培养过程中，因重力、曝气不均和球等鞭金藻的本身生理特性等，培养装置内壁或与藻液接触的物件上常常会出现贴壁现象。轻微的贴壁现象不会对藻细胞生长产生影响，但是一旦发生大规模贴壁现象，将产生恶性循环并形成不利影响，使藻细胞摄取营养困难、生存环境恶劣以及光照不足，如何在规模化培养球等鞭金藻中避免大规模贴壁现象的发生，是我们需要解决的技术问题。现有技术“CN105754861A”公开了一种减少小球藻贴壁的方法，包括在培养液中添加乳化剂，能够减少小球藻的贴壁，提高生物量；尽管该专利中认为添加乳化剂不会对小球藻的生长有不利影响，单是乳化剂会少量残留于藻类提取物中，为了提升藻类提取物的品质，我们要尽量避免乳化剂等化学物质的残留。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供了降低球等鞭金藻贴壁及提高生长量的方法，该方法可以显著降低球等鞭金藻的贴壁现象，提高生物量。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

降低球等鞭金藻贴壁及提高生长量的方法，其包括如下步骤：

将球等鞭金藻种子液按照5-10%的接种量接种到含有培养液的反应池中，然后添加100-200mg/L的氨基酸，20-22℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.4-0.5vvm；培养48-72h，收集藻细胞。

进一步地，

所述培养液的组分为：硝酸钠2g/L，碳酸钠0.5g/L，氯化铵0.2g/L，氯化钠0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，氯化铁 20mg/L，氯化锰 20mg/L，萘乙酸钠20mg/L，赤霉素10mg/L。

进一步地，

所述氨基酸为组氨酸、精氨酸或二者的混合物。

优选地，

所述氨基酸为组氨酸。

优选地，

所述氨基酸为组氨酸和精氨酸的混合物。

优选地，

所述氨基酸为组氨酸和精氨酸按照（1-3）:1的质量比的混合物。

优选地，

所述球等鞭金藻种子液的制备方法为：将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有种子培养基的种子罐中，接种初始密度为1×10⁵个/ml，光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm，培养48h，收集种子液。

优选地，

所述种子培养基的组分为：硝酸钠1.5g/L，硅酸钠0.5g/L，氯化钠0.3g/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，VB₁>12>

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：

本发明对培养液进行了优化，在培养液中通过添加萘乙酸钠和赤霉素，在培养过程中添加组氨酸，能够减轻藻细胞贴壁，提高球等鞭金藻的分裂速率，从而提高藻细胞生物量；研究发现，藻类贴壁主要发生在培养初期，因此，选择在规模化培养开始时添加组氨酸，组氨酸溶于水中，携带一定的正电荷，能够与表面带有负电荷的藻细胞通过化学键连接，从而诱导藻细胞悬浮培养，降低贴壁性能；而萘乙酸钠和赤霉素作为植物性调节剂，能够提高藻细胞的生长量。

带有正电荷的氨基酸能够降低贴壁现象，而其他氨基酸并不具备这种性能，而且，组氨酸不但具备降低贴壁现象，还能够刺激球等鞭金藻细胞增殖效率，效果优于精氨酸；因此，本发明选择使用组氨酸或者组氨酸和精氨酸的复合氨基酸。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

降低球等鞭金藻贴壁及提高生长量的方法，其包括如下步骤：

将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有种子培养基的种子罐中，接种初始密度为1×10⁵个/ml，光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm，培养48h，收集种子液；

所述种子培养基的组分为：硝酸钠1.5g/L，硅酸钠0.5g/L，氯化钠0.3g/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，VB₁>12>

将种子液按照5%的接种量接种到含有培养液的反应池中，然后添加200mg/L的氨基酸，22℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.5vvm；培养至72h，收集藻细胞；所述氨基酸为组氨酸。

所述培养液的组分为：硝酸钠2g/L，碳酸钠0.5g/L，氯化铵0.2g/L，氯化钠0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，氯化铁 20mg/L，氯化锰 20mg/L，萘乙酸钠20mg/L，赤霉素10mg/L。

实施例2

降低球等鞭金藻贴壁及提高生长量的方法，其包括如下步骤：

将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有种子培养基的种子罐中，接种初始密度为1×10⁵个/ml，光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm，培养48h，收集种子液；

所述种子培养基的组分为：硝酸钠1.5g/L，硅酸钠0.5g/L，氯化钠0.3g/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，VB₁>12>

将种子液按照5%的接种量接种到含有培养液的反应池中，然后添加100mg/L的氨基酸，22℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.5vvm；培养至48h，收集藻细胞；所述氨基酸为组氨酸和精氨酸按照2:1的质量比的混合物。

所述培养液的组分为：硝酸钠2g/L，碳酸钠0.5g/L，氯化铵0.2g/L，氯化钠0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，氯化铁 20mg/L，氯化锰 20mg/L，萘乙酸钠20mg/L，赤霉素10mg/L。

实施例3

降低球等鞭金藻贴壁及提高生长量的方法，其包括如下步骤：

将培养至对数生长期的球等鞭金藻接种到含有种子培养基的种子罐中，接种初始密度为1×10⁵个/ml，光照强度5000lux，22℃培养，光暗比为18:6，通气速率为0.2vvm，培养48h，收集种子液；

所述种子培养基的组分为：硝酸钠1.5g/L，硅酸钠0.5g/L，氯化钠0.3g/L，硫酸铵0.2g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，VB₁>12>

将种子液按照5%的接种量接种到含有培养液的反应池中，然后添加150mg/L的氨基酸，22℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.5vvm；培养至60h，收集藻细胞；所述氨基酸为组氨酸和精氨酸按照1:1的质量比的混合物。

所述培养液的组分为：硝酸钠2g/L，碳酸钠0.5g/L，氯化铵0.2g/L，氯化钠0.2g/L，硅酸钠0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，氯化铁 20mg/L，氯化锰 20mg/L，萘乙酸钠20mg/L，赤霉素10mg/L。

实施例4

球等鞭金藻生长情况检测：

以实施例1为实验组，同时设置对照组。

对照组1：培养过程中不添加组氨酸，其余同实验组；

对照组2：培养液中不添加萘乙酸钠，其余同实验组；

对照组3：培养液中不添加赤霉素，其余同实验组；

对照组4：培养液中不添加萘乙酸钠和赤霉素，其余同实验组；

观察各组别的藻细胞生长情况，其中，对照组1贴壁现象较为严重，聚集区出现部分细胞死亡，实验组和对照组2-4轻微贴壁，生长情况良好。

藻细胞干重测定：离心藻液，收集沉淀，置于100℃烘箱中烘干2h，干燥冷却后称量并计算，获得单位体积培养液中细胞干重含量(g/L)。具体结果见表1：

表1

组别细胞干重含量(g/L)贴壁现象实验组3.79轻微对照组12.65严重对照组23.16轻微对照组33.02轻微对照组42.88轻微

本发明还检测了不同的氨基酸类型的影响。

以实施例1为实验组，同时设置对照组。

对照组1：培养过程中用丙氨酸替代组氨酸，其余同实验组；

对照组2：培养液中采用精氨酸替代组氨酸，其余同实验组；

对照组3：培养液中采用组氨酸和精氨酸按照2:1质量比的复合氨基酸，其余同实验组。

具体结果见表2：

表2

组别细胞干重含量(g/L)贴壁现象实验组3.79轻微对照组12.83严重对照组23.29轻微对照组33.71轻微

分析：如表1所示，与对照组1-4相比，本发明实验组通过添加组氨酸、萘乙酸钠和赤霉素，能够减轻藻细胞贴壁，提高藻细胞生物量；其中，组氨酸溶于水中，携带一定的正电荷，能够与表面带有负电荷的藻细胞通过化学键连接，从而诱导藻细胞悬浮培养，降低贴壁性能；而萘乙酸钠和赤霉素作为植物性调节剂，能够提高藻细胞的生长量。如表2所示，本发明检测了多种氨基酸类型对藻细胞贴壁和生长量的影响，结果发现，带有正电荷的氨基酸能够降低贴壁现象，而其他氨基酸不具备这种性能，而且组氨酸不但具备降低贴壁现象，还能够刺激藻细胞增殖，效果优于精氨酸；因此，本发明选择使用组氨酸或者组氨酸和精氨酸的复合氨基酸。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。