一种乙炔雌二醇降解菌及其修复污染土壤的方法

摘要

本发明公开了一种乙炔雌二醇降解菌及其修复污染土壤的方法，包括：乙炔雌二醇降解菌为保藏编号CCTCC NO：M2017539的生丝微菌属，命名为Hyphomicrobium sp.GHH；本发明在农田中分离出乙炔雌二醇降解菌，该菌能去除土壤内的乙炔雌二醇；方法通过黑麦草和乙炔雌二醇降解菌联合修复乙炔雌二醇污染土壤，降解菌促进植物生长，且促进植物对乙炔雌二醇的提取和富集，从而明显提高植物对乙炔雌二醇污染土壤的修复效果。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物治理环境领域，特别是一种乙炔雌二醇降解菌及其修复污染土壤的方法。

背景技术

环境内分泌干扰物(EEDCs)以及其对人类和动物内分泌系统的影响正受到愈来愈多的 关注。乙炔雌二醇作为典型的环境内分泌干扰物，也是许多避孕药的活性成分。同时它还被 应用于前列腺癌和乳腺癌、更年期和绝经后综合症、骨质酥松等疾病的治疗。

乙炔雌二醇经由人体或动物排泄物进入环境。农田是粮食的主要来源地，而灌溉、径流 以及畜禽粪便等都会使乙炔雌二醇持续进入农田。有研究表明，乙炔雌二醇可以迅速吸附于 土壤和沉积物中。此外，乙炔雌二醇可以在植物如芸豆、芹菜等植物的根部富集，并由根部 转运到叶中。由此可见，农田土壤中的乙炔雌二醇将直接污染植物，同时也会以食物链的方 式危害人体和动物健康。

人体和鱼类的研究显示，乙炔雌二醇极易与雌激素受体结合，其雌激素效力是天然雌激 素的2-30倍。低浓度(ng/L)的乙炔雌二醇即可抑制鱼类的性腺和性别生长，破坏其内分泌 系统，影响其第二性特征。目前在污水处理厂、人工湿地、土壤、河流、地下水和含水层沉 积物、海水和海洋沉积物中都有检测出乙炔雌二醇的残留。乙炔雌二醇对人类健康、生物以 及生态的影响令人关注，其危害已也对人类生存和环境安全构成了隐患。

目前处理乙炔雌二醇的方式有吸附、光解、化学氧化、MBR以及生物技术等方法。物化 处理技术主要应用于污水处理厂的预处理及净水器的净水装置中，该方法用于土壤修复中时 修复成本高，修复范围局限。生物修复具有投资少，效率高等优点，是修复有机污染土壤的 研究热点。市场需要一种无污染、无公害、对环境友好的处理技术，本发明通过微生物和植 物联合修复技术解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乙炔雌二醇降解菌及其修复污染土 壤的方法，在农田中分离出乙炔雌二醇降解菌，该菌能去除土壤内的乙炔雌二醇；本发明通 过黑麦草和乙炔雌二醇降解菌联合修复乙炔雌二醇污染土壤，降解菌促进植物生长，且促进 植物对乙炔雌二醇的提取和富集，从而明显提高植物对乙炔雌二醇污染土壤的修复效果。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种乙炔雌二醇降解菌，包括：乙炔雌二醇降解菌为保藏编号CCTCC NO：M2017539的生丝微菌属，命名为Hyphomicrobium sp.GHH。

前述的一种乙炔雌二醇降解菌，名称为：Hyphomicrobium sp.GHH的乙炔雌二醇降解菌 的16SrDNA的测序结果为：

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前述的一种乙炔雌二醇降解菌，乙炔雌二醇降解菌从杭州农田取土样，用MSM培养基 加EE2作为唯一碳源培养分离得到。

前述的一种乙炔雌二醇降解菌，Hyphomicrobium sp.GHH具有降解EE2的能力。

一种乙炔雌二醇降解菌的修复污染土壤的方法，包括：在乙炔雌二醇污染土壤上种植黑 麦草，在黑麦草的生长过程中添加乙炔雌二醇降解菌，乙炔雌二醇降解菌为保藏编号CCTCC NO：M2017539的生丝微菌属，命名为Hyphomicrobium sp.GHH。

前述的一种乙炔雌二醇降解菌的修复污染土壤的方法，在黑麦草的生长过程中添加3次 乙炔雌二醇降解菌。

前述的一种乙炔雌二醇降解菌的修复污染土壤的方法，在黑麦草种子发芽3天后，开始 添加乙炔雌二醇降解菌菌悬液，共添加3次，每隔14天添加一次。

前述的一种乙炔雌二醇降解菌的修复污染土壤的方法，乙炔雌二醇降解菌菌悬液的添加 量为每2kg污染土样添加6-14mL>600＝0.8～1.2的菌悬液。

前述的一种乙炔雌二醇降解菌的修复污染土壤的方法，乙炔雌二醇降解菌菌悬液的添加 量为每2kg污染土样添加10mL>600＝1的菌悬液。

前述的一种乙炔雌二醇降解菌的修复污染土壤的方法，在黑麦草的生长过程中定期浇水， 保持土壤含水率为田间最大持水量的60％。

本发明的有益之处在于：

本发明在农田中分离出乙炔雌二醇降解菌，乙炔雌二醇降解菌能去除土壤内的乙炔雌二 醇；降解试验表明，当接种在新鲜MSM培养液中时，GHH在24h内迅速增长，然后变得稳 定，24h对EE2降解率为20％；

本发明通过黑麦草和乙炔雌二醇降解菌联合修复乙炔雌二醇污染土壤，降解菌促进植物 生长，且促进植物对乙炔雌二醇的提取和富集，从而明显提高植物对乙炔雌二醇污染土壤的 修复效果；该技术在28d对土壤中EE2的去除率为94％，在42d时对土壤中EE2的去除效 果高达99％。

附图说明

图1是本发明乙炔雌二醇降解菌的OD₆₀₀值和EE2的浓度变化。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一种乙炔雌二醇降解菌，包括：乙炔雌二醇降解菌为保藏编号CCTCC NO：M2017539的生丝微菌属，命名为Hyphomicrobium sp.GHH，保藏单位为：CCTCC-中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2017年9月25日。

^△菌的筛选鉴定过程如下所示：

土样于2016年10月取自杭州某农田。称取5g土，悬浮于100mL无机盐培养基(MSM)(NH₄Cl>2PO₄0.5g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O>4·7H₂O>20.03g/L，MnSO₄·H₂O>40.001g/L，pH>-1菌液，再将菌液以此稀释成10^-2～10^-7的稀>

采用Ezup柱式细菌、真菌基因组DNA抽提试剂盒(厂家)提取菌的DNA。以菌株的基因组DNA为模板，分别扩增16SrDNA基因；

16SrDNA扩增的PCR反应所用的正向引物Pf：5’CAG AGTTTGATCCTGGC T 3’；反向引物Pr：5’AGGAGGTGATCCAGCCGCA 3’。

取扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段纯化后送上海生工生物技术有限公司 测序，将测序结果进行BLAST同源性比较确定菌种。

将筛选出的单菌落接入MSM中富集培养，再以初始浓度OD₆₀₀＝0.01接入含4mg/LEE2>600和EE2残留浓度，评价所>

^△菌的筛选鉴定结果如下：

(1)菌形态特征

经平板筛选，从土壤中筛选出1株能够以EE2为唯一碳源生长的降解菌株。将其划线于 平板上，进过3-5d培养，菌落形态特征如下：菌落呈圆形，白色半透明，表面光滑，边缘整 齐。革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌。

(2)菌种鉴定

16SrDNA的测序结果为：

5’-CGCTGGCGGCAGGCGTAACACATGCAAGTCGAACGCCCCGCAAGGGGAGTGGCAGA CGGGTGAGTAACACGTGGGAACCTTCCCTATAGTACGGAATAGCCCAGGGAAACTTGGA GTAATACCGTATACGCCCGAGAGGGGAAAGATTTATCGCTATAGGATGGGCCCGCGTAGG ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTTTGAGAG AACGACCAGCCACACTGGGAGTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT GGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGG CCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTGCCGGGGACGATAATGACGGTACCCGGAGAATAAGT CCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGACTAGCGTTGTTCGGAA TCACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGTGGATTTGTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCT CAACCTCGGAACTGCCTTTGATACTGCAAGTCTTGAGTCCGATAGAGGTGGGTGGAATT CCTAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTAGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCCC ACTGGATCGGTACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATGCTAGCCGTTGGATAGCTTGCTATTCGGTGG CGCAGCTAACGCATTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCG AAGAACCTTACCAGCTCTTGACATTCACTGATCGCCTGGAGAGATCCGGGAGTCCCAGC AATGGGCAGTGGGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGG TTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCT AGTGGGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGC CCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAATGCGCAGCCACCTAGC AATAGGGCGCTAATCGCAAAAAGCCGTCTCAGTTCAGATTGAGGTCTGCAACTCGACCT CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGG GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTCTTACCCTAAAACGGTGCGCT AACCGCAAGGAGGCAGCCGGCCACGGTAAGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAA-3’

将该基因测序结果提交Genbank，用BLAST进行同源性比对。结果表明，菌株与Hyphomicrobium sp.MC1的16SrDNA序列相似度达99％，结合生理生化及形态特征，推断其为生丝微菌属，并将其命名为Hyphomicrobium sp.GHH。将该分离菌株保藏于中国类型培养中心(保藏编号为CCTCC M 2017539)。

^△验证Hyphomicrobium>

如图1所示，降解试验表明，当接种在新鲜MSM中时，GHH在24h内迅速增长，然后 变得稳定，24h对EE2降解率为20％。

一种乙炔雌二醇降解菌的修复污染土壤的方法，包括：在乙炔雌二醇污染土壤上种植黑 麦草，在黑麦草种子发芽3天后，开始添加乙炔雌二醇降解菌菌悬液，共添加3次，每隔14 天添加一次，乙炔雌二醇降解菌菌悬液的添加量为每2kg污染土样添加6-14mL>600＝0.8～1.2的菌悬液，作为一种优选，乙炔雌二醇降解菌菌悬液的添加量为每2kg污染土样添加10mL>600＝1的菌悬液。需要注意的是，在黑麦草的生长过程中定期浇水，保持土壤含水率为田间最大持水量的60％。

^△验证黑麦草和乙炔雌二醇降解菌(Hyphomicrobium>

实验地点设在浙江工商大学环境学院温室内，盆栽试验土壤采自杭州郊外某农田。所有 处理中乙炔雌二醇浓度为25mg/kg，供试土壤过5mm筛后装盆，每盆18.5cm(直径)×21cm (高)装土2kg(干重)，盆下垫托盘。

乙炔雌二醇以溶液的形式加入土壤，并充分混匀，加水至田间持水量的60％，在温室内 稳定15天后用于试验，每盆种植200株黑麦草。

本实验共设置4个处理组，其分别是：(1)不添加菌悬液和不种植黑麦草的空白组(C)； (2)单独添加菌悬液(B)；(3)单独种植黑麦草(P)；(4)添加菌悬液和种植黑麦草(B+P)，每 处理组设3个平行。每个处理均设3个重复。黑麦草种子发芽3天后，进行黑麦草与乙炔雌 二醇降解菌的单独或联合修复，每隔14天添加一次降解菌。降解菌每次添加量都分别为10mL， 共添加3次。

于黑麦草发芽后第14、28、42天采集植物样，将收获的植物样品分为根部和地上部分， 用自来水反复冲洗植株，最后用吸水纸将表面的水吸干，然后测定植物根长。取部分植物地 上部分在105℃下杀青2h，再在80℃下烘干，称量其干重。剩余部分放入密封袋中低温保藏 用于后续测定。

实验结果如表1～2所示。

表1黑麦草对乙炔雌二醇的提取效率、转运系数和富集系数

表2各处理组土壤中乙炔雌二醇的去除效率

实验结果表明，黑麦草和乙炔雌二醇降解菌(Hyphomicrobium sp.GHH)联合修复技术是一 种能够有效修复乙炔雌二醇污染土壤的修复技术。该技术在28d对土壤中EE2的去除率为 94％，在42d时对土壤中EE2的去除效果高达99％。该技术显著提高了黑麦草对乙炔雌二醇 的富集和转运能力，促进了黑麦草对乙炔雌二醇的植物提取效率。

本发明提供一种乙炔雌二醇降解菌及其修复污染土壤的方法，在农田中分离出乙炔雌二 醇降解菌，该菌能去除土壤内的乙炔雌二醇；本发明通过黑麦草和乙炔雌二醇降解菌联合修 复乙炔雌二醇污染土壤，降解菌促进植物生长，且促进植物对乙炔雌二醇的提取和富集，从 而明显提高植物对乙炔雌二醇污染土壤的修复效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解， 上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案， 均落在本发明的保护范围内。