Generating amphioxus Hedgehog knockout mutants and phenotype analysis

摘要

文昌鱼隶属脊索动物门头索动物亚门,是无脊椎动物到脊椎动物的过渡类群,其躯体结构简单,是研究胚胎发育的理想材料。本文以文昌鱼为实验对象,利用TAlEn敲除技术对HEdgEHOg(HH)基因在胚胎发育中的功能进行了研究。在文昌鱼HH基因翻译起始位点下游附近选取TAlEn目标位点,根据此序列组装相应TAlEn重组质粒,体外合成M rnA,向未受精卵注射M rnA后,经体外受精获得f0代胚胎。效率分析显示,靶向该基因的TAlEn M rnA可导致f0代代胚胎在相应基因组区域发生突变的比例为34%。对部分f0个体所产配子筛查发现,TAlEn引起的突变可进入配子,将其中1尾突变类型为8 bP缺失的雄性个体与野生型雌性配对获得f1群体,对f1群体逐尾筛查,从中获得多尾携带8 bP缺失的杂合子;这些杂合子相互配对所产的f2代胚胎,其中约有1/4个体在幼体早期出现躯体前端和尾向下弯曲、脊索前端腹侧的中胚层组织发育不全,不能开口等;随着幼体生长发育,躯体前端和尾部进一步卷曲,口部仍未形成,左右各形成一个口前窝,内柱和鳃裂位于躯体腹侧,最终因无口摄食而死亡。基因型分析发现,上述畸形胚胎均为HH纯合突变体,其与杂合子及野生型比例分布符合孟德尔遗传定律,表明这些发育畸型的特征与HH基因功能缺失有关。