Synthèse de dérivés glucosylés du 1,5-anhydro-D-fructose à l'aide de glucane-saccharases natives et recombinantes

摘要

Le développement d’un procédé de synthèse de l’AF catalysée par l’-(1,4) glucane-lyase rendudaujourd’hui la molécule facilement accessible à partir d’amidon. Sa valorisation fait l’objet du projetudeuropéen NEPSA auquel sont intégrés mes travaux de thèse. Ils sont focalisés sur la synthèse deuddérivés glucosylés de l’AF à l’aide de glucane-saccharases (GS). Ces enzymes catalysent à partir deudsaccharose le transfert d’unités glucosyle sur des molécules exogènes dites acceptrices.udPour la première fois, il a été démontré que l’AF est reconnu comme accepteur par les GSudproduites par des souches de Leuconostoc mesenteroides et Neisseria polysaccharea. Les produits deudglucosylation sont des anhydro-D-fructo-glucooligosaccharides (AFGOS) résultant de transfertsudsuccessifs d’unités glucosyle sur l’AF. Des familles d’AFGOS de structures différentes peuvent êtreudsynthétisées par l’utilisation de GS de spécificités distinctes.udLes AFGOS produits par la réaction d’accepteur conservent un fort pouvoir anti-oxydant mais sontuddépourvus de propriétés prébiotiques. La réactivité particulière de l’AF a également été mise à profitudpour la dérivation quantitative, spécifique et rapide de l’AF et des AFGOS en oximes.udLa production des AFGOS a été optimisée en contrôlant le rapport molaire saccharose/AF et laudmatière sèche pour atteindre des taux de conversion compris entre 50 et 80 % selon la GS utilisée.udD’autre part, l’utilisation de variants de GS obtenus par ingénierie rationnelle permet d’améliorerudencore la glucosylation de l’AF. Pour isoler de nouvelles enzymes plus efficaces par criblage deudbanques de variants générés par ingénierie combinatoire, une méthode basée sur la réductionudspécifique de l’AF a été développée.udThe development of the of 1,5-anhydro-D-fructose (AF) production from starch catalysed by -(1,4)udglucanlyase makes now AF easily available. Its valorisation is currently the subject of the NEPSAudeuropean project in which my thesis work is involved. This work is focused on the synthesis of AFudglucosylated derivatives with glucansucrases (GS) which catalyse the transfer of glucosyl residuesudfrom sucrose to an exogenous molecule named acceptor.udWe have demonstrated for the first time that AF is recognized as an acceptor by the GS fromudLeuconostoc mesenteroides and Neisseria polysaccharea strains. The glucosylation products areudanhydro-D-fructo-glucooligosaccharides (AFGOS) which result from successive glucosyl transfers toudAF. Several AFGOS families of different structures are obtained owing to the specificity of the GSudused.udAFGOS present an anti-oxydant power as high as AF but no prebiotic effect. The reactivity of AFudwas also studied in the case of oxime derivatization, and we developed a fast, quantitative and specificudconversion of AF and AFGOS.udLast, the production of AFGOS was optimised thanks to the control of the sucrose/AF molar ratioudand the total sugar concentration, thus reaching conversions comprised between 50 to 80 % owing toudthe GS employed. In addition, the use of GS variants constructed by rational engineering enabled theudfurther increase of conversions. In order to isolate new enzymes improved for AF glucosylation andudwhich are generated by combinatorial engineering, a specific screening method based on the specificudAF reduction was developed.