Micro scale reactor system development with integrated advanced sensor technology: A modular approach to the development of microfluidic screening platforms

摘要

Interessen for bioteknologi har vokset støt, i en tid hvor de fleste industrier i stigende grad fokuserer på grøn omstilling og udvikling. Der er generelt stor fokus på at reducere og/eller eliminere mange af de miljøbelastende effekter fra industrielle processer. Dette afspejles i industrielle processers udviklingen, som går i retning mod at finde alternativer til anvendelsen barske opløsningsmidler og metalbaserede katalysatorer, samt at reducere antallet af reaktionstrin og mængden af genereret affald.Dette har betydet store fremskridt i udviklingen og anvendelsen af biologiske systemer, såsom biokatalysatorer og celler. Sådanne biologiske systemer giver mange procesmæssige fordele, såsom; 1) muligheden om at køre kemiske reaktioner ved mildere reaktionsforhold; 2) nye syntese reaktioner; 3) forbedret regio- og stereoselektivitet.; 4) overflødiggørelse af kemiske beskyttelses og af-beskyttelses reaktioner der er afhængige af brug af barske opløsningsmidler/kemikalier.Det er dog ret krævende at udvikle biologiske systemer til industrielle processer, idet udviklingen af fermenteringsprocesser og/eller biokatalysatorbaserede processer er komplekst. F.eks. ensartede enzymer kan håndtere ensartede substrater, men have meget stor variation i performance ved forskellige temperaturer. Derudover kan kombinationen af flere enzymer i kaskade reaktionssystemer kræve en fysisk adskillelse af enzymerne i processen, grundet påvirkningen af biprodukter og/eller inhibering fra forskellige reaktionskomponenter. Yderligere kan det tilføjes at visse celler har en hurtigere væksthastighed ved høje tætheder eller forskellige produkt koncentrationer afhængig af dannelsen af aggregater eller sammenhængende celler. Den brede vifte af biologiske molekyler og celler, der kan fremstilles vha bioprocesser, kræver således optimering af specifikke substrater eller driftsbetingelser der, som ovenfor illustreret, kan variere meget mellem dem. Dertil skal tilføjes at opdagelsen og tilpasningen af nye biokatalysatorer og/eller celler kræver omfattende udtagelse af miljøprøver og dannelsen af nye varianter, hvilket nemt kan resultere i tusindvis af biologiske systemer, der potentielt kan være af stor industriel og/eller klinisk interesse, som skal analyseres og evalueres på relativt kort tid.Analysesystemer der er i stand til at screene disse mange varianter af biokatalysatorer er derfor et meget vigtigt værktøj. Sådanne analysesystemer gør det muligt at analysere forskellige reaktioner og/eller fermenteringer i parallel ved forskellige reaktionsbetingelser. F.eks. varierende substratkoncentrationer, sammensætning af medier, etc. Dette gør det muligt at identificere mulige variationer, procesbetingelser, substrater og biokatalysatorer eller celler der har potentiale til industrielle applikationer.Dette behov for hurtig og omfattende karakterisering af biokatalysatorer har skubbet udviklingen af nye screeningsplatforme baseret på mikrofluidsystemer. Mikrofluidsystemer indebærer manipulation af små væskevolumener (μL til nL) i miniaturiserede beholder, kanaler og/eller strukturer. Fordelen ved miniaturisering er at masse og varmeoverførsel bliver markant hurtigere. Dog bliver overflade- og masseoverførselsbegrænsninger på grund afdiffusion også øget. Mikrofluidsystemer gør det muligt at bruge forskellige strategier for forskellige enhedsoperationer, der er involveret i sådanne optimerings- og screeningsundersøgelser, samt nye målings- og monitoreringsmetoder.Der er flere tilgange til at kombinere og/eller integrere enhedsoperationer i mikrofluidsystemer. Disse tilgange strækker sig fra integration på en enkelt chip til fuldt ud modulære elementer der er linket sammen med rør og slanger. Sidstnævnte mulighed giver stor fleksibilitet idet det er muligt at kombinere modulerne i den rækkefølge der er krævet, afhængig af hvad der ønskes testet.Hovedformålet med denne afhandling var at udvikle en screeningsplatform baseret på modulære mikrofluidsystemer, til at ”screene” biokatalysatorer. I denne afhandling præsenteres tre mikrofluidmoduler, der kan integreres og anvendes som en modulær undersøgelseplatform. Det ene modul er et mikroreaktormodul med integrerede oxygen-sensorer, samt et fortyndings og kvantificeringsmodul. Dette modul er kompatibelt med elektrokemiske sensorer og kontinuerlig termisk inaktivering af enzymer. De to sidste moduler blev udviklet specielt til applikationer i online screening. Fokus under udviklingen af disse moduler var på at opnå simpel og brugervenlig betjening af platformene, samt at de var nemme at forbinde med andre eksisterende platforme og kompatible med en lang række biokatalytiske reaktioner.Mikroreaktormodulet gjorde kontinuerlig monitorering af iltniveauer mulig og blev karakteriseret med en biokatalytisk oxideringsreaktion. Formålet med karakteriseringen var at identificere operationelle begrænsninger af systemet i form af iltudtømning ved visse enzym- og substratkoncentrationer. I samme system blev strategier for in-situ oxygen regenerering også testet, ved tilsætning af katalase og hydrogenperoxid, for at overvinde de operationelle iltbegrænsninger i systemet. Derudover blev reaktionerne i mikroreaktormodulet modelleret ved hjælp af strømnings beregninger, hvor der blev vist en god sammenhæng mellem modellen og de eksperimentelle data. Detter resulterede i ekstra indsigt i reaktionsdynamikken. Den samme mikroreaktor blev brugt til at screene variationer af en dioxygenase enzym i hele celler for deres potentiale til at omdanne alkensubstrater. Dette supplerede til screeningen af genetisk modificerede biokatalysatorer ved anvendelse af produktkvantificering ved reaktionens slutpunkt. Oxygenomdannelsesraten blev bestemt for hver variant, hvor et standard substrat blev brugt som screeningsparameter, for at bestemme varianten med hurtigst oxygen omdannelse som den bedste kandidat til fremtidig industribrug.Det andet modul blev udviklet for at kunne integrere forskellige typer af sensorer til at sikre online kvantificering. Modulet har en standardiseret samlingsopkobling, hvilket gør det muligt at forbinde andre mikrofluidmoduler eller standard laboratorie udstyr. Trykte elektrokemiske sensorer blev integreret gennem åbninger i modulet, der tillod nem udskiftning og dermed genbrug af modulet. Det udviklede modul omfattede også en blandings- / fortyndingskanal, der var vedlagt et to-sensorsystem, hvilket tillod at udvide sensorernes detekteringsområde ved at kontrollere fortyndingsfaktoren som målingen blev foretaget ved. Fortyndingsenheden blev optimeret vha fluid dynamiske beregningsmetoder, der gjorde det muligt at teste flere geometrier inden fremstillingen og derved bidrog til at accelerere modul udviklingen.Det tredje mikrofluidmodul blev udviklet for at sikre uspecifik inaktivering af biokatalysatorer (især enzymer) og derved sikre præcis kontrol af reaktiontidspunktet (opholdstiden) ved produktkvantificering i det samme modul. Denne kontrol er vigtig når forskellige reaktormoduler og/eller sensorer anvendes og ofte udskiftes. Det kan endvidere bidrage til at regulere biokatalysatorens tilstand, da det afhænger af temperatur og eksponeringstid. Dermed kan reversibel eller irreversibel denaturering af enzymerne opnås.De forskellige præsenterede moduler er nyttige tilføjelser til etableringen af en modulær mikrofluid værktøjskasse til biokatalysator screening. Modulerne tillader online overvågning af biokatalytiske reaktioner eller biotransformationer, kvantificering af reaktionsprodukter og kontrollerede reaktionsendepunkter på grund af præcis temperaturkontrol. Desuden giver de udviklede fluid dynamiske modeller mulighed for en bedre forståelse af den reaktion, der udføres i mikrosystemet. Modellen kan forbedres yderligere for at opnå online dataindsamling af reaktionskinetik ved kobling med en mekanistisk model. I tilfælde af den udviklede blandings- / fortyndingskanal muliggjorde den udviklede model en hurtig optimering af enhedsoperationen, hvilket reducerede omkostningerne og den tid, der blev brugt til en sådan indsats.Demonstration af potentialet for modulære mikrosystemer i bioteknologiske anvendelser var hovedformålet med det udførte arbejde præsenteret i denne afhandling. Formålet med denne afhandling var at, udover etablering ad de tre mikrofluidsystemer, give en bedre forståelse for potentialet i brugen af mikrofluidsystemer til procesudvikling i bioteknologi, hvor specielt den modulære tilgang i kombination med fluiddynamisk modellering byder på spændende muligheder til fremtidig procesudvikling.