Antimicrobial resistance in Danish pigs: A cross sectional study of the association between antimicrobial resistance and geography, exposure to antimicrobials, and trade

摘要

Antibiotikaresistens er et globalt problem, der påvirker både mennesker og dyr. Mange projekter erderfor iværksat for at løse problemet. Antibiotikaresistens i grise udgør et reservoir for antibiotikaresistens i mennesker. Det er derfor vigtigt at reducere niveauerne af antibiotikaresistens i grise. For at dette skal kunne lade sig gøre må man vide hvilke faktorer, der påvirker niveauerne af antibiotikaresistensen i grise. De danske svinebesætninger udgør en ideel forskningsenhed for studier i antibiotikaresistens og antibiotika forbrug. Dette skyldes, at grisene går sammen i sektioner og bliver håndteret ens. Derudover bliver det registeret, når grisene flyttes eller der indkøbes antibiotika til brug i besætningen. Formålet med dette ph.d.-projekt var at belyse, hvilke faktorer, der associeret med niveauerne af antibiotikaresistens i de danske svinebesætninger. Tre faktorers sammenhæng med antibiotikaresistens blev undersøgt. De tre faktorer var den geografiske placering af besætningen, livstids eksponeringen for antibiotika samt handelsmønstre. Det var nødvendigt at indsamle data for at undersøge de ønskede faktorer. Indsamlingen af data var kompliceret, da der var flere ukendte faktorer forud for indsamlingen herunder, hvor mange grise, der skulle indsamles prøver fra, hvorvidt stikprøven ville være repræsentativ for målpopulationen og hvordan antibiotikaeksponeringen skulle måles. Derfor blev der i forbindelse med dataindsamlingen lavet tre undersøgelser af, hvordan data bedst kunne indsamles. I hele projektet blev der taget udgangspunkt i syv antibiotikaresistensgener – ermB, ermF, sulI, sulII, tet(M), tet(O) og tet(W). Niveauerne af disse gener blev målt med qPCR (quantitativepolymerase chain reaction). De to erm-gener koder for resistens mod makrolider, de to sul-generkoder for resistens mod sulfonamide, og de tre tet-gener koder for resistens mod tetracyklin. Det blev undersøgt, hvor mange grise, der skulle tages prøver fra for at få et mål for niveauet af antibiotikarestens, der var repræsentativt for besætningsniveauet. Konklusionen var, at prøver fra 5 grise var tilstrækkeligt. Derudover blev det undersøgt, om der var overensstemmelse mellem gentagne målinger af flere trin i prøveanalysen. De trin, der blev undersøgt, var: 2 opløsninger af materiale fra samme prøve, 2 poolinger af samme opløste prøve og 2 kørsler af samme prøve på qPCR’en. Der var god overensstemmelse på alle tre trin. Endeligt blev der også fundet en poolingsmetode, der var hurtigere end den, der tidligere har været brugt, og med sammenlignelige resultater. Der blev indsamlet prøver fra 687 svinebesætninger i et tværsnitsstudie i februar og marts 2015. Der måtte udgår 6 besætninger, da de ikke levede op til de krav, der blev stillet til stikprøven. Prøverne blev indsamlet på fem slagterier på Sjælland og i Jylland. Prøvematerialet var fæces, som blevindsamlet ved at klemme en lille mænge fra endetarmsåbningen ud i et tomt prøveglas. Efter endt prøveindsamling blev DNA’et ekstraheret fra prøverne, og niveauerne af de syvantibiotikaresistensgener blev målt med qPCR. Eftersom prøverne var indsamlet på slagterierne, var det ikke muligt at vide på forhånd, hvilke besætninger, der kunne tages prøver fra. Det indebærer, at det ikke er muligt at undersøge forud for prøveudtagningen, hvorvidt besætningerne, der indgik i stikprøven, var repræsentative for målpopulationen og studiepopulationen. Derfor blev det testet, om besætningerne var repræsentative mht. geografisk placering og størrelse. Besætningerne, der indgik i stikprøven, var større end de besætninger, der ikke indgik i stikprøven. Derudover blev det fundet, at der var et område i Vestjylland, hvor besætningerne i stikprøven var underrepræsenterede, og at der var et område i Nordjylland, hvor besætningerne i stikprøven var overrepræsenterede. Et simuleringsstudie viste, at det ikke er muligt at opnå en stikprøve, der vil være fuldstændig tilfældigt fordelt i landet, samt at det var uundgåeligt, at besætningerne i stikprøven ville være større end de, der ikke indgik i stikprøven. Da det var et af formålene med dette ph.d.-studie at undersøge sammenhængen mellem antibiotikaeksponering og antibiotikaresistens, var der brug for et godt estimat for antibiotika forbruget. Dette estimat skulle afspejle antibiotikaeksponeringen gennem hele grisens liv, da tidligere studier har indikereret, at dette er vigtigt. Derfor blev der konstrueret en algoritme, der estimerer livstidseksponeringen for antibiotika. Det har tidligere været vist, at besætninger med husdyr, der ligger geografisk tæt på hinanden, har sammenlignelige niveauer af bakterier. Derudover har det også været vist, at visse former for fænotypisk antibiotikaresistens er blevet fundet i højere niveauer i visse geografiske områder. Derfor blev der i dette ph.d.-projekt undersøgt, hvorvidt der var områder i Danmark, hvor niveauerne af de specifikke antibiotikaresistensgener var signifikant højere eller lavere end i resten af landet. Der blev fundet enkelte områder med højere niveauer af antibiotikaresistens, ligesom der blev fundet enkelt områder med lavere niveauer. På trods af dette blev det konkluderet, at den geografiske placering af en svinebesætning ikke er af afgørende betydning for niveauet af antibiotikaresistens i besætningen. Antibiotikaeksponering er kendt for at være den vigtigste risikofaktor for forekomsten af antibiotikaresistens. Tidligere studier har primært fokuseret på at undersøge sammenhængen mellem antibiotikaeksponering og fænotypisk antibiotikaresistens i en lille stikprøve. Der blev i dette ph.d.-projekt undersøgt den kvantitative sammenhæng mellem eksponering af 11 forskellige antibiotikaklasser og niveauerne af de syv antibiotikaresistensgener. Nogle antibiotikaklasser var positiv korreleret med niveauerne af generne, mens andre var negativt korreleret. Selvom antibiotikaeksponering havde en effekt på niveauerne af antibiotikaresistensgenerne, forklarede det kun 10-42 % af variationen i niveauerne. Mikrofloraren i mave-tarmsystemet dannes kort tid efter, at en gris bliver født. De bakterier, der er med til at danne denne mikroflora, kommer fra grisens omgivelser inklusiv soen. Der har været studier, der har vist, at niveauet af antibiotikaresistens i en pattegris er påvirket af den mængde antibiotika, som soen har indtaget. Derfor var det interessant at undersøge, hvorvidt niveauet af antibiotikaresistensgenerne i slagtesvin var korreleret med niveauet af antibiotikaresistensgener, der kunne findes i den sobesætning, hvor slagtesvinene var født. Der blev fundet signifikante korrelationer mellem niveauerne af visse antibiotikaresistensgener i slagtesvinebesætninger og i de sobesætninger, hvor slagtesvinene var født. Korrelationskoefficienterne for sammenhængen var mellem 0,06 og 0,47. Af de tre faktorer, der blev undersøgt i dette ph.d.-studie, var det kun soens niveau af antibiotikaresistensgener og antibiotikaeksponeringen, der havde betydning for niveauet af antibiotikaresistens hos slagtesvinene. En stor del af variationen i resistensgenerne kan ikke forklares med de faktorer, der blev undersøgt i dette studie. Der er derfor meget at tage fat på i fremtidige studier.