Solvent engineering and other reaction design methods for favouring enzyme-catalysed synthesis

摘要

Afhandlingen undersøger forskellige metoder til at øge reaktionsudbyttet i enzymkatalyserede syntesereaktioner. Først undersøges brugen af ukonventionelle reaktionsmedier som ioniske væsker og organiske solventer, både som hovedsolvent og co-solvent. Til sidst undersøges brugen af mere klassiske metoder i reaktionsdesign såsom enzymimmobilisering og brug af en membranreaktor. To forskellige enzymtyper anvendes, nemlig ferulinsyreesteraser og sialidaser.Med sinapoylering af glycerol som eksempel blev det vist, at både anionen i den ioniske væske og ferulinsyreesterasernes struktur havde betydning for ferulinsyreesteraseaktivitet og -stabilitet i ionisk væske-systemer med 15 % (v/v) vand (buffer). Den kvantekemibaserede software COSMO-RS kunne forklare den observerede anioneffekt som et resultat af anionens tendens til at danne hydrogenbindinger med enzymstrukturen. Anvendeligheden af COSMO-RS og andre termodynamiske modeller i forbindelse med valg af solventer til ferulinsyreesterasekatalyserede reaktioner blev undersøgt. Ferulinsyreesterase type A fra Aspergillus niger og ferulinsyreesterasene i den kommercielle enzympreparation fra Humicola insolens, Depol 740L, kunne ikke katalysere esterificeringen af arabinose eller xylose med hydroxycinnamater i systemer af ionisk væske og buffer eller i mikroemulsioner. Dog kunne begge ferulinsyreesteraser katalysere feruloylering og/eller sinapoylering af kationen C2OHMIm+; dette understreger at ferulinsyreesteraserne har en bred acceptorspecificitet og således har potentiale for at kunne gøre nytte i andre, mere brugbare reaktioner med solventet.En modificeret sialidase fra Trypanosoma rangeli, Tr6, kan katalysere trans-sialylering, fx produktion af 3’-sialyllaktose fra laktose og kaseinglykomakropeptid (CGMP), men reaktionsudbyttet trækkes ned af substrat- og produkthydrolyse. Ved at tilsætte 20-25 % (v/v) t-butanol blev trans-sialyleringsudbyttet øget 1,4 gange, og forholdet mellem syntese og hydrolyse blev øget 1,2 gange. Forholdet mellem syntese og hydrolyse blev også øget ved at tilsætte ioniske væsker som co-solventer, men på bekostning af enzymaktiviteten. Tilbage i vandigt miljø kunne immobilisering af Tr6 på magnetiske nanopartikler øge forholdet mellem syntese og hydrolyse 2,1 gange og desuden give en 2,5 gange forøget biokatalytisk produktivitet (mg produkt pr. mg enzym). Desværre tabte de magnetiske nanopartikler en stor del af enzymaktiviteten i brug og kunne kun genbruges få gange. I stedet kunne frit Tr6 bruges i en membranreaktor med et 1,3 gange højere udbytte på sialyldonoren (CGMP) til følge; dette understreger, at kontinuert fjernelse af produktet vha. en membranreaktor er en brugbar metode til at undgå produkthydrolyse. Stabiliteten af Tr6 var høj i membranreaktoren, og 7 ganges genbrug resulterede i mere end 9 ganges forøgelse af den biokatalytiske produktivitet.Det kan konkluderes, at omhyggelig udvælgelse af både enzymstrukturer og solventsystemer nødvendig i reaktioner hvor ukonventionelle solventer kræves for at opnå et tilfredsstillende vi reaktionsudbytte, fx i den termodynamisk kontrollerede esterificering katalyseret af ferulinsyreesteraser. Med den modificerede sialidase Tr6 var resultaterne derimod mest lovende, når katalysen fandt sted i vandigt reaktionsmedium hjulpet på vej af kontinuert fjernelse af produktet eller enzymimmobilisering.