Development of bacterial resistance to biocides and antimicrobial agents as a consequence of biocide usage

摘要

Biocider er kemiske stoffer med antimikrobielle egenskaber og bruges i vid udstrækning til desinfektion, antisepsis og til konservering. Biocider er blevet anvendt i århundreder til eksempelvis rensning af sår med vin, eddike eller honning og til saltning af fisk og kød på grund af tidlige empiriske tilgange. I dag, bliver store mængder af biocider anvendt til desinfektion for at opnå et tilfredsstillende niveau af hygiejne i forskellige miljøer og anvendelsen af biocider er blevet en integreret del af den industrialiserede verden. Selvom biocider anvendes i vid udstrækning er viden omkring deres nøjagtige virkningsmekanisme relativt begrænset især ved sub-inhiberende koncentrationer. Det øget forbrug af biocider har inden for de seneste år ledt til bekymring om udviklingen og spredningen af biocid resistente bakterier,som muligvis kan besværliggøre bekæmpelsen af patogene bakterier. Endvidere er det blevet foreslået, at anvendelse af biocider kan bidrage til udviklingen af resistens hos bakterier over for antimikrobielle stoffer, der anvendes til behandling af mennesker og dyr. Indtil videre er det tydeligt at kryds- og co-resistens resistensmekanismer over for antimikrobielle stoffer og biocider findes, derimod er viden omkring biociders potentielle effekt på udviklingen af resistens overfor antimikrobielle stoffer i bakterier, forårsaget af den horisontale overførsel af resistensgener eller ved at øge mutations rate meget mindre kendt. Selvom biocider almindeligvis anvendes ved koncentrationer, som langt overstiger den dødelige dosis for bakterier, kan virkningsgraden af disse stoffer betydeligt blive reduceret ved forkert brug eller ved tilstedeværelsen af restkoncentrationer og dermed kan bakterier blive eksponeret til lave ikke dødelige koncentrationer.Det overordnet formål med dette projekt er at undersøge om naturlige bakterie isolater bliver mindre følsomme over for biocidstoffer, der anvendes i deres miljø og om dette kan lede til spredning af resistens overfor antimikrobielle stoffer i bakterier pga. co-selektion. Derudover, er formålet at undersøges effekten af eksponeringen af bakterier overfor sub-inhiberendekoncentrationer på udviklingen af resistens overfor antimikrobielle stoffer. Hidtil har kun få studier undersøgt følsomheden af husdyr-relaterede bakterie isolaters overfor biocider, som anvendes i deres miljø. Svin bliver i stigende grad anerkendt som et potentielt reservoir for samfundserhvervet methicillin resistente Staphylococcus aureus (MRSA), specielt kloner, som hører til det klonale komplex (CC) 398. For nyligt blev den første MRSA tilhørende CC30 identificeret i danske svin, som desuden også blev fundet i landmænd. Følsomheden i 79 svine S. aureus isolater overfor almindelige anvendte biocider i svine produktionen blev bestemt (Manuscript III). Biociderne bestod af benzalkonium klorid (BC), hydrogen peroxid (HP), natrium hypoklorit (SH), formaldehyd (FH) og kaustisk natron NaOH). S. aureus isolater udviste i almindelighed ikke nedsat følsomhed over for de testede biocider. Imidlertid blev et kvaternær ammoniumforbindelse (QAC) resistensgen, qacG, påvist i MRSA CC30 isolater. Tilstedeværelsen af qacG i MRSA CC30 er bekymrende, da brugen af QAC'er muligvis kan bidrage til selektionen og spredningen af disse isolater. MRSA CC30 er ofte forbundet med MRSA typer, der giver anledning til kliniske infektioner i mennesker i Danmark og svine MRSA CC30 kan derfor muligvis være tilbøjelig til at tilpasse sig til mennesker.Biocidrester eller ukorrekt anvendelse af biocider kan føre til at bakterier bliver eksponeret overfor sub-inhiberende koncentrationer. Cellens reaktion på en sådan eksponering er uklar. Det er blevet foreslået, at SOS responset i bakterier kan bidrage til udviklingen af resistens overfor antimikrobielle stoffer ved at øge forekomsten af mutationer i bakterien. Derfor blev effekten af sub-inhiberende koncentrationer af de fem almindelige biocider BC, CHX, HP, PAA og SH på SOS responset, indikeret ved brug af et recA-lacZ ekspressions assay, samt mutationsfrekvensen i S. aureus isolater undersøgt (Manuscript II). BC, CHX og HP øgede SOS responset. Desuden blev det påvist at HP og PAA øgede mutationsfrekvensen signifikant (p = 0,05) med 5-15 og 3-8 gange. Disse resultater tyder på, at eksponeringen overfor sub-inhiberende koncentrationer af HP og PAA kan bidrage til udviklingen af antimikrobiel resistens i S. aureus. Dette kan være af potentiel risiko for menneskers sundhed, da disse desinfektionsmidler i vidt omfang anvendes på hospitaler og i fødevareindustrien.Mobile genetiske elementer såsom konjugative transposoner er vigtige vektorer i udbredelsen af antimikrobielle resistensdeterminanter. Tn916, som indeholder tetracyklinresistensgenet tet(M) er et konjugativt transposon og prototypen på en stor familie af beslægtede elementer. De har et ekstremt bredt spektrum af bakterieværter og er blevet fundet i både sygdomsfremkaldende og kommensale bakterier. I studiet, som udgør Manuskript I blev effekten af sub-inhiberende koncentrationer af ETOH, HP, CHX og SH på overførslen af Tn916 undersøgt. ETOH blev fundet til signifikant (p 0,05) at øge overførsel af Tn916 5 gange i gennemsnit, hvorimod en gennemsnitlig øgning ioverførslen af Tn916 på 4 blev observeret (p = 0,12), når donor bakterier blev udsat for HP. Disse resultater tyder på, at eksponering overfor sub-inhiberende koncentrationer af ETOH og HP kan fremkalde udbredelsen af Tn916-lignende elementer og deres resistensgener, hvilket er af klinisk betydning da disse biocider ofte anvendes på hospitaler. Afslutningsvis blev der ikke fundet udbredt nedsat følsomhed over for dedinfektionsmidler, som oftest anvendes i svineproduktionen i S. aureus svine isolater. Imidlertid blev biocidresistensgenet, qacG, konstateret i flere af MRSA CC30 isolaterne. Dette gen er også fundet i andre dyre-relateredestafylokokker. Overvågning af forekomst af nedsat følsomhed over for biocider i bakterier opmuntres dog stadig, da dette vil give vigtige data til at afgøre, om nedsat følsomhed overfor biocider sker over tid. Vigtigere er det, at data fra denne afhandling har vist at visse biocider har potential til at bidrage til udviklingen af resistens overfor antimikrobielle stoffer i bakterier via øget mutationsfrekvens og ved øget overførsel af resistensgenet tet(M). På kort sigt understreger disse resultater, at korrekt anvendelse af biocider er af allerstørste betydning. På lang sigt er flere undersøgelser nødvendige for at belyse den faktiske risiko ved anvendelse af biocider på udviklingen af antibiotikaresistente bakterier i praksis.