Analysis of Swine Leukocyte Antigen Peptide Binding Profiles and the Identification of T cell Epitopes by Tetramer Staining

摘要

Immunsystemet har udviklet sig på en sådan måde, at det er i stand til specifikt at skelne mellem selv og ikke-selv strukturer. Ved at kombinere dette med evnen til effektivt at huske og forberede sig imod samtlige patogener, som det tidligere er stødt på, er af afgørende betydning for et korrekt og effektivt fungerende immunsystem og er selve grundstenen i ethvert design af vacciner. I alle hvirveldyr overvåger kroppens CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er) det intracellulære miljø i søgen efter tegn på invasion af udefrakommende patogene organismer såsom virus og bakterier. CTL'er overvåger major histocompatibilitets kompleks (MHC) klasse I molekyler, som er stærkt polymorfe peptid-receptorer, der udvælger og præsenterer endogent afledte peptider til cirkulerende CTL'er. Peptider, der genkendes af CTL'er i samspil med MHC molekylet, er såkaldte epitoper og repræsenterer et lille fragment af det patogene proteom, hvilket gør det muligt for immunsystemet specifikt at identificere og reagere imod fremmede peptid fragmenter, som er unikke for den invaderende patogen. MHC molekylets polymorfi er det, der individualiserer immunresponset for hvert enkelt individ i en given art. Endvidere genkender kroppens T-celler kun antigene peptid ligander, når de fremstår som del af det trimere peptid:MHC:β2m (pMHC) kompleks.Genet der koder for MHC er kendt som en af de mest polymorfe regioner i genomet. Til trods for eksistensen af tusindvis af forskellige humane leukocyt antigen (HLA) varianter, arver og udtrykker hvert medlem af en art kun et par stykker af disse MHC alleler. Selve "MHC fingeraftrykket" udtrykt af et individ, kan identificeres ved at definere MHC alleler. Den unikke MHC allel kan fastslås ved en metode, traditionelt kendt som ”vævstypebestemmelse”, som foretages ved at analysere perifere blod cellers reaktivitet overfor vævstypnings-sera. En sådan viden er afgørende, for at kunne analysere et immunrespons i forhold til MHC restriktion og CTL genkendelse af patogen-specifikke proteiner.Størstedelen af MHC proteinets polymorfi er lokaliseret i den peptidbindende kløft. Derfor er hvert enkelt MHC molekyle unikt i måden det binder peptid-antigener på og som følge heraf individualiseres også hele individets T-celle repertoire via MHC. På denne måde er de enkelte MHC molekylers forskellighed indenfor en bestemt art medvirkende til, at det stort set er umuligt for indtrængende patogener, at undslippe immun systemets søgelys.Karakterisering af individuelle SLA klasse I- og klasse II gen produkter og deres unikke peptid bindende kriterier definerer T-celle epitoper fra ethvert givent patogen proteom.Til dato er analysen af MHC klasse I molekylets evne til at binde og præsentere peptider, både i form af bindingsstyrke (affinitet) og stabilitet af peptid:MHC komplekset, blevet omfattende beskrevet i både mus og mennesker. Sådanne data er stadig relativt begrænsede for landbrugs dyr såsom svin. Denne ph.d. afhandling beskriver hvorledes analytiske tilgange, der oprindeligt er udviklet til mennesker og mus, kan tilpasses og anvendes i grise, for at opnå en bedre forståelse af de porcine MHC klasse I molekylers peptid-bindings karakteristika i forbindelse med immun responser rejst imod vaccinering eller infektion. En sådan anvendelse af tidligere afprøvede analyse metoder sammen med nyligt producerede, rekombinante SLA klasse I proteiner, førte til en betydelig mængde data for peptid:SLA:β2m (pSLA) kompleksets affinitet og stabilitet. Kortlægning af SLA proteinernes bindingsmotiver samt identifikationen af matchende virale peptider, gjorde det muligt at undersøge beskaffenheden af de forskellige SLA proteiner samt de roller, de spiller i etableringen af adaptiv immunitet. Udviklingen af pSLAbaserede tetramerer muliggjorde endvidere studier af specifikke CTL responser fremkaldt som et resultat af immunisering mod mund- og klovesyge virus (MKS) og svine influenza A virus.Disse undersøgelser resulterede i identifikationen af T-celle epitoper fra begge virus.Med stadigt stigende mængder peptid bindings data for de forskellige SLA molekyler, opnået igennem disse samt andres studier, er det muligt for vores samarbejdspartnere på Center for Biologisk Sekvensanalyse (CBS), DTU, yderligere at styrke og forbedre den peptid forudsigende algoritme NetMHCpan. Denne forudsigelses algoritme er nu i stand til at udpege peptid kandidater til binding af både humane (HLA), kvæg (BoLA) og svine (SLA) MHC proteiner.Ved at udvide kendskabet til porcine MHC klasse I molekyler, kortlægge deres peptid bindings motiver og producere pSLA baserede tetramerer, samt forbedre nutidens aktuelle tekniske niveau indenfor metoder til at forudsige SLA peptid binding, kan vi modernisere immunologisk videnskabelige studier i landbrugs dyr. Disse fremgangsmåder og resultater må forventes at føre til en fremskyndet og forbedret udvikling af vacciner med forøget effektivitet, på grund af optimal aktivering af det cellemedierede immunrespons med tilhørende minimale bivirkninger.