Einfluss der elF4A bindenden Domäne aus elF4G auf Konformation und Aktivität der minimalen DEAD Box Helikase elF4A aus Saccharomyces cerevisiae

摘要

In dieser Arbeit wurde die Aktivität der minimalen DEAD Box Helikase eIF4A (eIF4Ay) und ihre Regulation durch die eIF4A bindende Domäne von eIF4G (eIF4Gy(572-853) aus S. cerevisiae charakterisiert.udeIF4Gy(572-853) beschleunigt die ATP Hydrolyserate kcat von eIF4Ay um den Faktor 2,5, von 0,004 s-1 auf 0,010 s-1. Gleichzeitig steigt der KM-Wert für polyU RNA von 30 µM auf 125 µM. Die Geschwindigkeit der dsRNA Entwindung wird durch die Gegenwart von eIF4Gy(572-853) aber halbiert.udDie Stimulierung der ATPase Aktivität wird nicht durch die Erhöhung der Nukleotidaffinität verursacht. Im Gegenteil reduziert eIF4Gy(572-853) die Affinität von eIF4Ay für ADP von KD = 50 µM auf 90 µM und für ATP von KD = 20 mM auf über 30 mM, wie unabhängig in ITC und Fluoreszenztitrationen gezeigt wurde. Stattdessen deutet die Verdopplung der mADP Dissoziationsrate koff von 30 s-1 auf 60 s-1 durch eIF4Gy(572-853) auf eine Funktion von eIF4Gy(572-853) als Nukleotidaustauschfaktor hin.udeIF4Ay und eIF4Gy(572-853) interagieren über zwei Bindungsstellen. In smFRET Experimenten wurde gezeigt, dass die sekundäre Bindungsstelle zwischen der N terminalen Domäne von eIF4Ay und der C terminalen Domäne von eIF4Gy(572-853) durch Einfügen drei negativ geladener Aminosäuren in eIF4Gy(572-853) (K831E, S834D und R835E) zerstört werden kann. Diese Mutationen verursacht im Vergleich zu wildtyp eIF4Gy(572-853) lediglich eine Erhöhung der Dissoziationskonstante des Komplexes von 0,6 µM auf 1,1 µM. Dementsprechend trägt die sekundäre Bindungsstelle weniger als 5% zur Wechselwirkungsenergie des eIF4Ay/Gy(572-853) Komplex bei.udsmFRET Ergebnisse zeigten, dass eIF4Ay durch eIF4Gy(572-853) in einer Konformation stabilisiert, die sich deutlich von der geschlossenen (ATP und RNA gebundenen) und der offenen (ligandenlosen) Konformation unterscheidet. Für die Stabilisierung dieser Konformation ist der Kontakt über beide Bindungsstellen erforderlich. Mutationsstudien zeigten, dass eine Salzbrücke zwischen eIF4Gy(572-853) R835 und E43 aus dem nukleotidbindenden Q Motiv von eIF4Ay für die Stimulierung der ATPase Aktivität notwendig ist. Außerdem vermittelt eIF4Gy(572-853) durch seinen Einfluss auf die Konformation von eIF4Ay den ersten Interdomänenkontakt zwischen den RNA bindenden Motiven Ib und QxxR und orientiert so die RNA Bindungsstelle.udAufgrund dieser Daten kann folgendes Modell der Regulation der eIF4Ay Aktivität durch eIF4Gy(572-853) vorgeschlagen werden:udeIF4Gy(572-853) wird über die primäre Bindungsstelle an eIF4Ay verankert, während die deutlich schwächere Wechselwirkung der sekundären Bindungsstelle die Orientierung der Domänen verursacht. Der Kontakt in der sekundären Bindungsstelle kann transient abbrechen, sodass eIF4Ay zwischen der katalytisch aktiven geschlossenen Konformation und der eIF4Gy(572-853) gebundenen Konformation wechseln kann. Der Übergang von der geschlossenen in die eIF4G gebundene Konformation öffnet die Nukleotidbindungstasche und beschleunigt dadurch den Nukleotidaustausch, einen für DEAD Box Proteine ratenlimitierenden Schritt. Gleichzeitig bleibt aber der Interdomänenkontakt zwischen Motiv Ib und QxxR bestehen, sodass der Übergang zurück in die katalytisch aktive geschlossene Form erleichtert ist.ududIn einem methodisch orientierten Teil dieser Arbeit wurde an der Isolierung von Aptameren für die FRET Farbstoffe A488 und A546 zur Reinigung doppelmarkierter Proteine durch ‚Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment’ (SELEX) gearbeitet. Weiter wurden Möglichkeiten zur Identifikation oberflächenexponierter Cysteinen durch chemische Fragmentierung der Proteine untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Grundlagen für einen in vivo Helikasetest mit RNA Thermometern entwickelt. Außerdem wurden nachfolgende Arbeiten zur Erforschung der Wechselwirkung von eIF4A mit eukaryotischen Translations Initiationsfaktoren durch die Klonierung von eIF4Am, eIF4Gm, eIF4Gm(686-1090), eIF4Gm(1226-1600), eIF4E und eIF4Aleif vorbereitet. Der aktuelle Stand zur Erforschung der DEAD Box Proteine wurde in einem Übersichtsartikel zusammengefasst (Hilbert, M. et al. 2009 Biol Chem. 390(12), 1237–1250).