Die DEAD-box Helikase Hera aus 'Thermus thermophilus'. Untersuchung der Wechselwirkung mit Nukleinsäuren und der Helikaseaktivität

摘要

Hera ist eine DEAD-Box Helikase aus Thermus thermophilus. Wie bei vielen anderen DEADbox Helikasen auch, ist wenig über die physiologische Rolle von Hera bekannt. Vorangegangene Untersuchungen ergaben, dass der ATPase-Umsatz von Hera vor allem durch ribosomale 16S und 23S RNAs, sowie RNase P RNAs stimuliert wurde. Ausserdem wurde eine Entwindungsaktivität für DNA-RNA Hybride dokumentiert. Desweiteren zeigte sich, dass die spezifische Stimulierung ausblieb, wenn die C-terminale Domäne um etwa 140150 Aminosäuren verkürzt wurde. In diesem deletierten Bereich wurde ein Motiv vermutet, welches eine schwache Sequenzhomologie mit den RNase P RNA-Bindemotiven bakterieller RnpAs aufweist. Eine Beteiligung an der ribosomalen Biogenese wurde als mögliche Funktion in vivo vorgeschlagen (Morlang et al., 1999). Hera bildet als einzige bisher beschriebene DEAD-box Helikase ein stabiles Dimer aus, welches sich durch eine hohe intramolekulare Flexibilität auszeichnet (Klostermeier & Rudolph, 2009). Diese ersten Einsichten wurden in der vorliegenden Arbeit konkretisiert und erweitert. Es wurde der ATP-Umsatz von Hera in Ab- und Anwesenheit von RNAs bestimmt, sowie die Entwindung doppelhelikaler Bereiche von RNA-Minimalsubstraten. Verwendet wurden hierzu Hydrolysetests für den ATP-Umsatz im Fliessgleichgewicht oder als Einzelumsatz, sowie Entwindungstests mit nativer Polyacrylamidgelelektrophorese. Da bisher wenig über die in vivo Substrate von Hera bekannt war, lag ein Schwerpunkt der Arbeit auf der Eingrenzung möglicher Substrate, welche die Helikase aktivieren. Hierunter versteht man die Konformationsänderung, welche eine DEAD-box Helikase aufgrund der Substratbindung durchläuft, wie durch Theissen et al. (2008) beschrieben. Konfokale Einzelmolekül-FRETMessungen waren das geeignete Mittel der Wahl, da hiermit die mit der Substratbindung einhergehende Konformationsänderung der Helikase beobachtet und als Indikator für die Substraterkennung verwendet werden konnte. Desweiteren wurde die Bedeutung einzelner Motive und Domänen für ATP-Umsatz, Substraterkennung und Entwindung durch gezielte Mutation und Deletion untersucht. Es zeigte sich, dass der ATP-Umsatz in Gegenwart von poly U RNA, RNase P RNA und rRNA stimuliert wird. Diese Substrate führen auch eine Konformationsänderung der Helikase herbei, wogegen DNAs und tRNAs nicht von Hera erkannt und gebunden werden. Bei den rRNAs handelte es sich hierbei fast ausschliesslich um Fragmente der 23s rRNA aus B. subtilis, welche hairpin 92 beinhalten. Hera wechselte den Konformationszustand, wennudderen Länge 30 Basen oder mehr betrug. Sequenz oder Länge des hairpins und des angrenzenden loops waren allerdings nicht entscheidend. RNase P RNAs führten zu Konformationsänderungen, egal ob sie vom Typ A und B waren, oder ob die Substratbindedomäne oder die katalytische Domäne verwendet wurden. Wildtypisches Hera war in der Lage, ein RNA-Minimalsubstrat unter ATP-Verbrauch zu entwinden. Entfernte man die letzten 145 Aminoäuren der C-terminalen Domäne, so verliert die verbleibende Helikasedomäne ihre Fähigkeit zur spezifischen RNA-Bindung und ihre Entwindsaktivität. Die RNA-Bindedomäne von Hera ist also in diesem Teil zu vermuten. Eine Mutation des vermuteten RNase P RNA-Bindemotivs allerdings beeinträchtigt die RNABindung und Entwindung nicht. Sie ist daher nicht, wie vermutet, ein integraler Bestandteil der RNA-Bindedomäne. Und Kompetitionsexperimente mit Rnpa aus E. coli lassen die Schlussfolgerung zu, dass beide Proteine an unterschiedliche Bereiche der RNA binden können. Mutationen in Motif III, welches in DEAD-box Helikasen eine Kopplung von ATPHydrolyse und Entwindungsaktivität herstellt, verlangsamen die Entwindung lediglich, behindern sie aber nicht vollständig. Durch eine Mutation von Motiv I, dem Walker A Motiv, wird die ATPase-Aktivität vollständig eingestellt. Funktionelle Bereiche von Hera wurden in dieser Arbeit detailliert untersucht, genauso wie die Anforderungen an ein in vivo RNA-Substrat. Die hier vorgestellten Experimente und Ergebnisse liefern somit den Grundstein für weitere Untersuchungen dieser Helikase und somit für das Verständnis von DEAD-box Helikasen im Allgemeinen.ududud