Targeted delivery of advanced functionality by nanomaterials : focus on nucleic acids delivery by novel block copolymers

摘要

Abstract: Smart drug delivery systems are versatile examples of successful nanomedicine withudpotential in diagnostics and medical therapy. The thesis presents selectedudapproaches in current drug delivery systems in the (pre-)clinical trials, and deals withudpotential side effects, including complement activation and hypersensitivity reactionsudas well as the design requirements of the delivery systems. Furthermore, it presentsudapproaches of cationic block copolymers, which are capable to condense negativelyudcharged nucleic acid molecules such as plasmid deoxyribonucleic acid (pDNA) andudsmall interfering ribonucleic acid (siRNA) with the aim of efficient cell gene deliveryudand specific gene suppression, respectively.udThe first part addresses the transfection efficiency of circular versus linearizedudplasmid DNA using a green fluorescent protein expressing vector with Lipofectamineud2000 and linear 25 kDA polyethylenimine (PEI). These results show a considerablyudimproved transfection efficiency with the circular compared to the linearized DNA forudthe two transfection reagents. The electron microscopy images with Lipofectamine orudPEI demonstrate that the circular DNA gives rise to random coil appearance ofudcompact, spherical shape, while linearized DNA appear as worm-like strands.udParticle size and shape are important in the cell biology of endocytosis andudphagocytosis. The findings indicate that the shape of the transfection particle is vitaludfor successful gene transfer.udTo develop a delivery system for gene therapy, two cationic diblock copolymersudconsisting of primary and tertiary amines were synthesized and analyzed withudrespect to DNA condensation properties, morphology of the condensed plasmid DNAudand transfection efficiency using two cell lines. This study revealed proof-of-conceptudshowing an order of magnitude lower transfection efficiency of primary amine diblockudcopolymers compared to PEI after 48 h with increasing plasmid DNA concentration.udFurthermore, primary amines compared to tertiary ones show much stronger bindingudto DNA and improved transfection efficiency. Transmission electron and atomic forceudmicroscopy data revealed morphologies of primary and tertiary amines regarding theudcondensation of the plasmid DNA, in agreement with the transfection efficiency.udIn a second part the design and characterization of pentablock-based polyplexesudbased on the combination of cationic pentablock copolymers with folic acidudfunctionalized copolymers for targeted specific siRNA delivery is described. Theudachieved 31 % knockdown efficiency shows its potential regarding cancer geneudtherapy. The pentablock architecture allows the formation of highly stableudmicelleplexes of (21 ± 3) nm in 10 mM PBS buffer solution with a neutral surfaceudcharge, excellent siRNA condensation properties, outstanding colloidal stability inud10 % serum over 24 h and biocompatibility deduced from the absence ofudconsiderable cytotoxicity even after 48 h incubation. Furthermore, selective deliveryudof the siRNA could be proven by the introduction of a ligand-linked block copolymer,udresulting in 31 % compared to 8 % gene suppression for targeted a non-targetedudmicelleplexes. This pentablock-based delivery system might yield impact to futureuddelivery systems as well as being a potential platform to be applied in vivo for cancerudgene therapy. ---------- ZusammenfassungudInnerhalb des Bereichs der Nanomedizin weisen intelligente Wirkstoffabgabesystemeudein großes Potenzial auf, sowohl hinsichtlich der Diagnostik wie auch derudmedizinischen Therapie. Die vorliegende Arbeit stellt im Rahmen einerudLiteraturrecherche ausgewählte Wirkstoffabgabesysteme vor, welche sich in (vor-)udklinischen Studien befinden, den Nebenwirkungen welche durch diese entstehenudkönnen, im speziellen der Komplementaktivierung und Überempfindlichkeitsreaktionen,udsowie deren Konstruktionsanforderungen. Des weiteren werden in einemudexperimentellen Teil kationische Block-Kopolymere präsentiert, welche in der Lageudsind, negativ geladene Nukleinsäuremoleküle zu binden - wie etwa PlasmidudDesoxyribonukleinsäure (pDNA) und kleine interferierende Ribonukleinsäurenud(siRNA) - mit dem Ziel der Transfektion von fremder DNA in die Wirtszellen unduddamit der spezifischen Unterdrückung der Genexpression.udDer erste Teil der experimentellen Arbeit untersucht die Transfektionseffizienz vonudzirkulärer gegenüber linearisierter Plasmid-DNA mittels eines Vektors, welcher einudgrün fluoreszierendes Protein exprimiert. Transfiziert wurde einerseits mitudLipofectamine 2000 und andererseits mit linearem 25 kDa Polyethylenimin (PEI),udzwei etablierten Transfektionsreagenzien. Die Ergebnisse zeigen eine wesentlichudverbesserte Transfektionseffizienz der zirkulären, verglichen mit der linearisiertenudDNA für beide Transfektionsreagenzien. Die elektronenmikroskopischen Bilder vonudLipofectamine sowie PEI komplexiert mit DNA zeigen, dass die zirkuläre DNAudzufällige, kompakte Kugelformen bildet, während die linearisierte DNA wurmartigeudStränge aufweist. Partikelgröße und -form spielen in der Zellbiologie eine wichtigeudRolle bei der Endozytose und Phagozytose. Die Ergebnisse legen die Vermutungudnahe dass die Form der zu transfizierenden DNA-Transfektions-Komplexen eineudwichtige Rolle einnimmt für einen erfolgreichen Gentransfer.udFür die Entwicklung eines intelligenten Wirkstoffabgabe-Systems für die Gentherapieudwurden zwei kationische Diblock-Kopolymere, die aus primären und tertiären Aminenudbestehen synthetisiert und im Hinblick auf deren DNA-Kondensationseigenschaften,udMorphologie der kondensierten Plasmid-DNA sowie Transfektionseffizienz unterudVerwendung von zwei Zelllinien analysiert. Die Studie bestätigt trotz einer um denudFaktor 10 schwächeren Transfektionseffizienz der primären Amin-DiblockKopolymerenudim Vergleich zu PEI nach 48 h mit zunehmender pDNA Konzentrationudeine Bestätigung des Konzepts. Außerdem weisen die primären Amin-Block-udKopolymere im Vergleich zu den tertiären eine viel stärkere Komplexbildung der DNAudauf - wie transmissions-elektronen- und rasterkraft-mikroskopische Daten ergaben -udals auch eine verbesserte Transfektionseffizienz. Diese physikalischmorphologischemudErkenntnisse über die Kondensation der primären und tertiärenudAmine mit Plasmid-DNA konnten mittels der biologischen Transfektionseffizienzdatenudvalidiert werden.udDer zweite Teil der experimentellen Arbeit befasst sich mit dem Design sowie derudCharakterisierung von pentablock-basierten Polyplexen für einen gezielten siRNAudTransport. Diese Polyplexe beruhen auf einer Kombination von kationischenudPentablock-Kopolymeren mit folsäure-funktionalisierten Kopolymeren. Die erreichtenud31% Gen-Suppression in einem Krebszellkulturmodell, zeigen das Potenzial desudWirkstoffabgabesystems in Bezug auf eine Krebstherapie auf. Die Architekturudermöglicht die Bildung von sehr stabilen Mizellen mit einer Grösse von (21 ± 3) nm inud10 mM PBS Pufferlösung, eine neutrale Oberflächenladung, ausgezeichneten siRNAKondensationseigenschaften,udhervorragender kolloidaler Stabilität inudZellkulturmedium supplementiert mit 10 % Serum über 24 h, sowie guterudBiokompatibilität aufgrund fehlender erheblicher Zytotoxizität auch nach 48 hudInkubation in einem Zellkulturmodell. Ferner konnte durch die Einführung einesudliganden-gebundenen Block-Kopolymers der selektive Transport der siRNAudnachgewiesen werden, was zu einer Gen Suppression von 31% gegenüber 8% nichtudfunktionalisierter Polyplexen führte. Das in dieser Arbeit eingeführte undudcharakterisierte pentablock-basierte Wirkstoffabgabesystem könnte Auswirkungenudauf das Design zukünftiger Wirkstoffabgabesystem haben als auch als eineudpotentielle Plattform für in vivo-Krebsgentherapien angewendet werden.