Aromaten- und Chloraromatenabbau durch Pseudomonas sp. Stamm B13: 3-Oxoadipat:SuccinylCoA-Transferase und 3-OxoadipylCoA-Thiolase

摘要

Die 3-Oxoadipat:SuccinylCoA-Transferase und die 3-OxoadipylCoA-Thiolase aus sp. B13 wurden gereinigt und untersucht. Eine Methode zum Nachweis verschiedener CoA-Ester durch HPLC wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert.Eine native Molekularmasse der B13-Transferase von 115 ± 5 kDa wurde ermittelt. Durch SDS-PAGE wurden zwei Enzymuntereinheiten A und B mit Größen von 32,9 und 27,0 kDa nachgewiesen. Diesen Daten entsprechend handelt es sich bei der B13-Transferase um ein heterotetrameres Enzym des Typs AB mit einer Molekularmasse von 119,8 kDa. Die N-terminale Aminosäuresequenz der Enzymuntereinheiten der B13-Transferase wurden wie folgt bestimmt:Untereinheit A: .Untereinheit B: .Ein Vergleich dieser Sequenzen mit Transferasen aus anderen Aromaten-abbauenden Organismen belegt eine geringe Identität.Die K - und V -Werte der Transferase betragen 0,4 mM bzw. 10,3 U/mg für 3-Oxoadipat und 0,2 mM bzw. 24,2 U/mg für Succinyl-CoA. Die katalytische Konstante beträgt 1430 min-1. Die B13-Transferase setzt keine in 2- und 4-Position halogenierten 3-Oxoadipate um. Auch 2-Methyl-3-oxoadipat ist kein Substrat der Transferase. Eine sehr geringe Transferase-Aktivität konnte gegenüber 4-Methyl-3-oxoadipat, sowie für 2-Oxoadipat und 3-Oxoglutarat gezeigt werden.Eine native Molekularmasse der B13-Thiolase von 162 ± 13 kDa wurde bestimmt. Durch SDS-PAGE wurde eine Größe von 42 kDa für die Enzymuntereinheit der B13-Thiolase ermittelt. Entsprechend der gefundenen Daten ist die B13-Thiolase ein homotetrameres Enzym des Typs A mit einer Molekularmasse von 168 kDa. Die N-terminale Aminosäuresequenz der Enzymuntereinheit der B13-Thiolase wurde bestimmt:Untereinheit: (? = unbestimmte Aminosäure).Ein Sequenzvergleich zu Thiolasen anderer Organismen zeigt einen hohen Grad an Übereinstimmung.Die K - und V -Werte der B13-Thiolase betragen 0,15 mM bzw.1,5 U/mg für 3-OxoadipylCoA und 0,01 mM bzw. 0,9 U/mg für CoA. Die katalytische Konstante beträgt 470 min-1.