Genetic studies on the biosynthesis of the major aminoglycoside antibiotics: Isolation, analysis and comparison of the biosynthetic gene clusters for 12 aminoglycoside antibiotics

摘要

Die Dissertation befaßt sich hauptsächlich mit der Aufklärung der Genetik und der postuliertenBiosynthesewege der 2DOS- und verwandten Aminocyclitol-Aminoglykosid-Antibiotika (ACAGAs). Folgende Ergebnisse konnten mittels der beschriebenen Vorgehensweisen erzielt werden: 1) Durch die Konstruktion homologer und heterologer Sonden (Primer) konnten aus den entsprechenden Cosmidbänkenpositiv hybridisierende Cosmide identifiziert werden. Die anschließenden Analysen (Restriktion, PCR,Cosmidkarte) wurde durchgeführt um die Cosmide für die Sequenzierung auszuwählen, dieACAGAs-Gencluster (oder Teile davon) enthielten; 2) Die Insertsequenzen einzelner bzw. überlappender Cosmid-Klone wurde sequenziert, analysiert, undbei der EMBL Genbank eingereicht; 3) Die Biosynthese-Gencluster für Neomycin, Ribostamycin, Paromomycin, Lividomycin, Kanamycin,Tobramycin, Gentamicin, Fortimicin, Istamycin, Apramycin und Hygromycin B wurden analysiert undvollständig sequenziert. Das Butirosin-Gencluster konnte nur teilweise charakterisiert werden; 4) Weiterführende Aussagen über einen allgemeinen Biosyntheseweg für die entsprechenden ACAGAskonnten getroffen werden; 5) Ein Charakteristikum der , - und -Cluster ist, daß einige der zentral wichtigenGene, ebenfalls konserviert in anderen ACAGAs Genclustern sind, in der Vergangenheit dupliziert odersogar multipliziert wurden, und so neue biosynthetische Funktionen erworben wurden.Interessanterweise, ergab die Analyse der , - und-Cluster hoheEvidenz dafür, daß die Gentamicine Produkte sind, die aus einem Hybrid der Kanamycin/FortimicinBiosynthesewege entstanden sind. 6) Es wurden verschiedene heterologe Primer entwickelt um Biosynthesegene ausunterschiedlichen ACAGA produzierenden Stämmen zu detektieren und ihre Anwendbarkeit getestet; 7) Aus dem Kanamycin Biosynthese-Gencluster wurden die drei Gene , und ausgewählt, um die Genprodukte biochemisch zu charakterisieren. Um dies zu erreichenwurden die drei Gene kloniert und in und/oder TK23 expremiert.Die entsprechenden Enzymaktivitäten wurden mit DC, HPLC und spektrophotometrischen Analysen bele8) codiert für eine 2-Desoxy--Inosose Synthase, für eine2-Desoxy--InososeAminotransferase, sowie für eine 1-keto-2,3-Desoxy-3-Amino--Inositol- Aminotransferase(bifunktionelles Enzym) und kanE für eine 2-Desoxy--Inosamine-1-Dehydrogenase(in Anwesenheit von Zn Ionen und NAD).