Membrangebundenes IL-17A und IL-17F zur Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper für die intrazytoplasmatische Zytokinfärbung

摘要

Die Charakterisierung der Zytokine beim Haushuhn ist Schwerpunkt vieler Forschungsarbeiten. Insbesondere die IL-17 Zytokine stehen, aufgrund ihrer immunregulatorischen Funktionen im Säuger, im Fokus der Forschung. Fünf homologe IL-17 Zytokine wurden im Genom des Haushuhnes identifiziert. Ihre Regulation und Funktion ist jedoch weitgehend unerforscht. Die Phänotypisierung zytokinspezifischer Zellen im Haushuhn ist nur eingeschränkt möglich und setzt die Generierung spezifischer mAK voraus. Die Herstellung zytokinspezifischer mAK basiert auf der Immunisierung von löslichem Protein. ududZiel dieser Arbeit war die Etablierung einer neuen Methode, welche die Notwendigkeit großer Mengen an aufgereinigtem Zytokin umgeht. Dafür wurden Hühnerzytokine über einen GPI-Anker auf der Oberfläche von eukaryotischen Zellen fixiert. Es wurden zwei stabile Zelllinien generiert, welche gg IL-17A beziehungsweise gg IL 17F über einen GPI-Anker auf ihrer Oberfläche hoch exprimieren. Die transfizierten Zelllinien wurden für die Immunisierung und das Screening der Hybridome in der Durchflusszytometrie genutzt. Auf Basis des Färbeverhaltens der Hybridome auf transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen wurden zwei gg IL-17A-spezifische mAK (9F11, 10D5) und ein gg IL-17F-spezifischer mAK (1E7) selektiert. Die Spezifität der mAK wurde aufgrund ihrer Hemmung durch rekombinante gg IL-17-Proteine bewiesen. Western Blot Analysen der rekombinanten Zytokine weisen auf eine dimere Proteinstruktur hin. Ein proinflammatorischer Effekt von gg IL-17A und gg IL-17F auf die Makrophagenzelllinie HD11 ist zudem nachweisbar. Beide Zytokine induzieren die Expression von IL-6 sowie die Freisetzung von Stickstoffmonoxid. ududDie generierten mAK färben natives gg IL-17A und gg IL-17F intrazellulär in transfizierten eukaryotischen Zelllinien sowie in primären Hühnerzellen. In der Milz ist eine Population gg IL-17A- sowie gg IL-17F- produzierender CD4+ Lymphozyten darstellbar, wobei es sich wahrscheinlich um Th17-Zellen handelt. ududZusammenfassend stellt das Verfahren, Zytokine über einen GPI-Anker auf eukaryotischen Zellen zu exprimieren, eine erfolgreiche Methode dar, spezifische mAK zu produzieren. Die generierten mAK 1E7, 9F11 und 10D5 repräsentieren, durch ihre Fähigkeit Zytokine intrazytoplasmatisch detektieren zu können, ein wichtiges Instrument, die Expression sowie die biologische Funktion von gg IL 17A und gg IL-17F im Haushuhn weiter zu charakterisieren und die IL-17- produzierenden Zellen auf Einzelzellebene zu untersuchen.