Funktionelle Charakterisierung des Komplexes aus Ornithin-Decarboxylase, Antizym und Antizym-Inhibitor sowie Identifikation einer Antizym-Inhibitor-Spleißvariante durch Bindung an FK506

摘要

Das von (Licitra and Liu, 1996) entwickelte Hefe-3-Hybrid-System ermöglicht die in vivoIdentifikation von Ligand-Rezeptor-Interaktionen. Es ist eine Weiterentwicklung desklassischen Hefe-2-Hybrid-Systems und beinhaltet den Einsatz eines synthetischenHybridmoleküls. Der feste Bestandteil dieses Hybridmoleküls ist das Hormon Dexamethason,das über die Hormon-bindende Domäne des Glukokorticoidrezeptors in der Hefezelleverankert wird und kovalent mit einem Molekül verbunden ist, für das der Interaktionspartnergesucht wird. Ziel dieser Arbeit war es, das Hefe-3-Hybrid-System im Labor zu etablierenund das System zur Identifikation neuer Interaktionspartner für das ImmunsuppressivumFK506 einzusetzen. Um das Hefe-3-Hybrid-System sensitiver zu gestalten, wurde zunächstder ABC-Transporter PDR5 deletiert, der an dem Export von Steroidhormonen beteiligt ist.Dabei wurde gezeigt, daß der Pdr5-Transporter auch chemisch modifizierte Steroidhormonewie beispielsweise Dexamethason-Linker transportiert. Darüberhinaus wurden zweiAminosäurepositionen innerhalb der Hormon-bindenden Domäne des Glukokorticoidrezeptorsidentifiziert, die entscheidend zur die Aktivierbarkeit des Rezeptors beitragen. ImRahmen des durchgeführten 3-Hybrid-Screens wurde zusätzlich zu dem bekannten FK506-Bindeprotein, FKBP12, eine unbekannte, C-terminal verkürzte Spleißvariante von Antizym-Inhibitor als neuer Interaktor für FK506 identifiziert. Die Interaktion war FK506-spezifisch,da keine Interaktion mit anderen an Dexamethason gekoppelten Liganden nachzuweisen war.Die im 3-Hybrid-Screen isolierte Spleißvariante wurde zusätzlich über RT-PCR amplifiziert,wobei noch eine weitere Spleißform von Antizym-Inhibitor identifiziert werden konnte. Eswurde gezeigt, daß beide Formen ubiquitär exprimiert werden und Homologe in der Mausexistieren.Antizym-Inhibitor ist an der Regulation der Polyaminbiosynthese beteiligt. Polyamine spielenfür das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und die Proteinbiosynthese eine essentielleRolle. Die Aktivität von Antizym-Inhibitor wird anhand seiner Fähigkeit bestimmt, Ornithin-Decarboxylase (ODC, EC 4.1.1.17) aus dem inhibitorischen Komplex mit Antizymfreizusetzen. Die freigesetzte ODC-Aktivität gibt somit Auskunft über die Antizym-Inhibitor-Aktivität. Bei den Antizymen handelt es sich um eine Proteinfamilie, die aus vier Mitgliedernbesteht, deren Interaktion mit Antizym-Inhibitor bislang nur für Antizym 1 beschrieben ist.Für die Charakterisierung der Antizym-Inhibitor-Spleißvarianten, wurde ein nichtradioaktiverAktivitätsassay entwickelt, der auf der funktionellen Expression von humanerODC, Antizym und Antizym-Inhibitor in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beruht. Dabeiwurde gezeigt, daß humane ODC die Deletion der Hefe-ODC (∆spe1) komplementiert und sodas Hefezellwachstum auf Polyamin-freiem Medium ermöglicht. Dieser Assay erwies sich auch als geeignet für ein Hochdurchsatzverfahren (HTS) zur Identifikation von ODCInhibitoren.Die Koexpression von Antizym führte zu einer Wachstumshemmung, die aufeinem Polyaminmangel beruht und durch Zugabe von Putrescin, oder durch die zusätzlicheKoexpression von Antizym-Inhibitor wieder aufgehoben werden konnte. Darüber hinauswurde ein 3-Hybrid-Assay für den Proteinkomplex aus ODC, Antizym und Antizym-Inhibitorentwickelt. Hiermit wurde untersucht, inwieweit Antizym-Inhibitor die Heterodimerisierungzwischen ODC und Antizym unterbindet. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte erstmals gezeigtwerden, daß Antizym-Inhibitor in der Lage ist, an alle Proteine der Antizym-Familie zubinden und ODC aus dem Komplex mit Antizym 1, 2, 3 und 4 verdrängt. Bislang war dies nurfür Antizym 1 beschrieben. Desweiteren wurde für das noch nicht charakterisierte Mitgliedder Antizym-Familie, Antizym 4, gezeigt, daß auch dieses an ODC bindet und die Aktivitätder ODC hemmt. Die C-terminal verkürzte Spleißvariante konnte zwar an die Antizyme 1, 2und 3 binden, war jedoch nicht der Lage, ODC aus dem Komplex freizusetzen. Um dieAntizym-Bindungsdomäne von Antizym-Inhibitor weiter zu charakterisieren, wurdenFragmente hergestellt mit deren Hilfe die Antizym-Bindungsdomäne auf einen Bereich vonLeucin45 bis Serin300 eingegrenzt werden konnte. Die Antizym-Bindungsdomäne überlapptdabei mit der FK506-Bindungsdomäne, die vollständige Form von Antizym-Inhibitor bindetinteressanterweise nicht an FK506. Zusammengefaßt zeigt dies, daß der C-Terminus vonAntizym-Inhibitor von großer Bedeutung für die Konformation des Proteins ist und einenwichtigen Beitrag zur Stabilisierung der Antizym / Antizym-Inhibitor-Interaktion leistet. DieRelevanz der in der Hefe gewonnenen Daten wurde abschließend mit HEK 293-Zellextraktenüberprüft. Die Komplexbildung der transient exprimierten Proteine ODC, Antizym undAntizym-Inhibitor konnte durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Damit wurdegezeigt, daß die Hefe-Daten auf höhere Organismen übertragen werden können.