Etablierung eines zellulären genetischen Screeningverfahrens zur Suche nach Regulatoren des Glucocorticoidrezeptors und Identifizierung von Cofilin 1 als Glucocorticoidrezeptor-Inhibitor

摘要

Glucocorticoidresistenz ist ein Phänomen, das bei vielen Krankheiten eine wichtige Bedeutung hat. Insbesondere wird vermutet, dass ihr eine kausale Rolle bei depressiven Erkrankungen zukommt. In den meisten Fällen kommt die Resistenz durch eine Fehlfunktion des Glucocorticoidrezeptors zustande. Deswegen ist es von grossem Interesse, den Signalweg dieses Rezeptors im Detail zu verstehen. In der Vergangenheit wurde viel zum Verständnis beigetragen, unter anderem indem eine Reihe von GR-Regulatoren identifiziert und deren Wirkungsmechanismus aufgeklärt wurde. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Faktoren zu finden, die in die GR-Signaltransduktion verwickelt sind. Dazu wurde ein funktioneller Screen durchgeführt, der darauf beruhte, GC-resistente Zellen herzustellen, diese mit responsiven Zellen zu vergleichen und damit Kandidaten zu identifizieren, die möglicherweise die GR-Funktion regulieren. Für die Herstellung hormonresistenter Zellen wurde eine humane Zelllinie hergestellt, die in Anwesenheit von Hormon nicht überleben kann; diese wurde zufallsverteilt mutiert und in GC-haltigem Medium selektiert. Drei hormonresistente Klone konnten die Selektion überleben, einer davon wurde im Detail charakterisiert, dessen Proteinexpressionsmuster mittels 2D-Gelektrophorese mit derjenigen der Ausgangszelllinie verglichen und die unterschiedlich exprimierten Faktoren mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Dies führte zur Identifikation von vier Kandidaten: Thioredoxin, hsp27, Reticulocalbin und Cofilin 1, deren Wirkung auf den GR in verschiedenen Zelllinien getestet wurde. Während die ersten drei keinen Einfluss auf den GR hatten, konnte Cofilin als neuer GR-Inhibitor etabliert werden. Cofilin ist gut untersucht als Depolymerisierungsfaktor des Actin-Cytoskeletts, eine Rolle im Signalweg des GRs oder eines anderen Transkriptionsfaktors war bis jetzt jedoch nicht bekannt. Es zeigte sich, dass seine inhibitorische Wirkung auf den GR von seiner Funktion in der Actin-Regulation abhängig war, und ausserdem, dass Cofilin eine Veränderung der intrazellulären Rezeptorverteilung vor Hormongabe bewirkte. In nachfolgenden Experimenten wurde gefunden, dass sowohl die chemische Zerstörung des Actin-Cytoskeletts wie auch die direkte Erhöhung des Anteils an freiem Actin zur GR-Inhibierung und veränderten Rezeptorverteilung führt. Des Weiteren wurde entdeckt, dass erhöhte Mengen an freiem Actin den bekannten GR-Inhibitor c-Jun induzieren, wodurch folgendes Modell aufgestellt wurde: Cofilin erhöht durch seine Actin-Depolymerisierungsfunktion freies Actin, damit wird über einen noch unbekannten Mechanismus c-Jun induziert, welches wiederum den GR inhibiert. Damit wurde über einen zellulären genetischen Screen Cofilin 1 als ein neuer GR-Regulator identifiziert und nachfolgend der inhibierende Wirkungsmechanismus von Cofilin aufgeklärt.