Studie über die Genregulation der Expression der 3alpha-Hydroxysteroid-Dehydrogenase im Bakterium Comamonas testosteroni

摘要

Die Fähigkeit vieler Mikroorganismen, Steroide und Steroidanaloga als Kohlenstoffquellen im Boden zu nutzen, ist schon lange bekannt. Die Mikroorganismen bauen zu diesem Zweck das energiereiche steroidale Ringsystem durch eine Vielzahl von Enzymen bis zur Bildung ringfreier Carbonsäuren und CO2 komplett ab. Der Abbau des Sterangerüstes kann nur durch Enzyme bakterieller und einiger niederer eukaryontischen Organismen bewerkstelligt werden. Zu diesen Organismen gehört das gram-negative Bakterium Comamonas testosteroni, das seine steroidabbauenden Enzyme nicht konstitutiv exprimiert, sondern einer Induktion durch die Substrate selbst unterliegt. Neben einer Reihe von steroidabbauenden Enzymen wurde auch das Schlüsselenzym 3alpha-Hydroxysteroiddehydrogenase/Carbonylreduktase (3alpha-HSD/CR) identifiziert, das die Aromatisierung des A-Ringes durch Oxidation einleitet und dadurch den weiteren Steroidabbau ermöglicht. Als Ausgangssequenz wurde das Plasmid p6, ein in einen „high-copy-number“-Vektor kloniertes DNA-Fragment mit einer Größe von 5.275 kb, verwendet. p6 enthält die Gensequenz für die 3alpha-Hydroxysteroiddehydrogenase (hsdA), die Gensequenz für ein weiteres am Steroidstoffwechsel beteiligtes Enzym (3-ksi) und vier offene Leserahmen (orf 1-4), die mögliche Regulationselemente der 3alpha-HSD codieren. Im Labor von Prof. Dr. E. Maser wurden mittels Computeranalysen von p6 zwei zu einander pallindromi-sche Sequenzen mit einer Länge von 10 Nukleotiden gefunden, die als mögliche Opera-toren fungieren (OP1, OP2). Es konnte mit Hilfe von EMSA eine spezifische Bindung eines von orf4 codierten Proteins (Repressor A) an die Operatoren der 3alpha-HSD und eine Blockade der Expression von hsdA nachgewiesen werden (Xiong et al, 2003). In Anwesenheit von Testosteron löst sich Repressor A von OP1/OP2 und ermöglicht so die Transkription von hsdA (Xiong et al., 2001). In weiterführenden Experimenten wurden die Repressorproteine mit Hilfe von His-tag-Säulen gereinigt und Antikörper präpariert. Als nächster Schritt ist hier der spezifische Bindungsnachweis von Repressor A an OP1 und OP2 mittels „Footprint-Analysen“ geplant. Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war, einen Beitrag zur Aufklärung der Regulation der 3alpha-HSD/CR zu leisten und weitere mögliche Regulationselemente zu identifizieren. Dabei lag der Schwerpunkt in der Herstellung von so genannten Marker Suicide Plasmiden, die durch gezielte Integration in die chromosomale DNA von Comamonas testosteroni bestimmte Regulationselemente – insbesondere orf2/Repressor B – in ihrer Funktionsweise stören bzw. zerstören sollten. Durch eine anschließende Messung der Expression von hsdA erhoffte man sich, Rückschlüsse auf die Funktionsweise dieser Regulationselemente ziehen zu können. Zur Integration der Marker Suicide Plasmide in chromosomale DNA wurden zwei verschieden Methoden verwendet: „Mating“ und Elektroporation: Es konnte gezeigt werden, dass beide Methoden effektiv sind und zu einer stabilen Integration führen. Die erfolgreiche Integration wurde mittels Kultur, PCR und Southern Blot bewiesen. Die Messungen der Expression von hsdA mit Hilfe von HPLC und ELISA zeigten keine eindeutigen Ergebnisse, die Rückschlüsse auf die vermutete Repressorfunktion von orf2/Repressor B zuließen. Weiterführende Untersu-chungen der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. E. Maser konnten nachweisen, dass orf2 seine repressorische Aktivität auf mRNA-Ebene entfaltet (Xiong et al., 2003). Die Entschlüsselung des Regulationsmechanismus des Enzyms 3alpha-Hydroxysteroid-dehydrogenase/Carbonylreduktase im steroid-metabolisierenden Bakterium C. testosteroni könnte Bedeutung haben für Medizin und Umwelt: Zum einen ist durch Applikation von gentechnisch veränderten steroidabbauenden Mikroorganismen eine neue Möglichkeit der Therapie von Patienten mit koronarer Herzkrankheit aufgrund einer Hypercholesterinämie vorstellbar. Zum anderen ist der Einsatz dieser Bakterien in Gewässern denkbar, die durch eine steroidbedingte Feminisierung gefährdet sind.