Identifizierung von cis- und transregulatorischen Elementen der 3-alpha Hydroxysteroiddehydrogenase/ Carbonylreduktase-Expression in Comamonas testosteroni

摘要

Die molekularbiologischen Grundlagen des Steroidmetabolismus gelten auf dem Gebiet der eukaryontischen Organismen als ein bereits gut erforschtes Gebiet. Im Bereich der Prokaryonten konnten bisher wenig Erkenntnisse gewonnen werden. Das gram-negative Bakterium Comamonas testosteroni ist ein steroidmetabolisierender Organismus, der seine steroidabbauenden Enzyme und auch seine im Steroidmetabolismus eingesetzten Transport- und Bindeproteine nicht konstitutiv exprimiert, sondern einer Induktion durch die Substrate selbst unterliegt. Die Mechanismen dieser Steroidinduktion sind bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Es wurden bisher eine Reihe von Enzymen identifiziert, die am vollständigen Abbau der Steroide bis zur Bildung von H2O und CO2 beteiligt sind. Ein Schlüsselenzym ist die 3-alpha-Hydroxysteroiddehydrogenase/ Carbonylreduktase, die die Aromatisierung des A-Rings durch Oxidation katalysiert und dadurch die Spaltung des B-Ringes und den weiteren Abbau ermöglicht. Ziel dieser Arbeit war es, die Regulation der 3-alpha-HSD/ CR zu untersuchen und mögliche Regulationselemente wie Operatoren und Repressoren zu identifizieren. Mit Hilfe von Aktivitätsmessungen und Bandshift-Assays wurden Regionen einer definierten DNA-Sequenz geprüft. Als Ausgangssequenz wurde ein in einen high-copy-number -Vektor kloniertes DNA-Fragment verwendet, das Plasmid p6 mit einer Länge von 5.275 kb. Das Insert von p6 enthält die Gensequenz für die 3-alpha-Hydroxysteroiddehydrogenase (hsdA), die Gensequenz für ein weiteres am Steroidstoffwechsel beteiligtes Enzym (3-ksi) und verschiedene offene Leserahmen (orf 1-4), die mögliche Regulationselemente der 3α-HSD codieren. Es wurden in vorher in der Arbeitsgruppe durchgeführten Computeranalysen von p6 zwei zueinander palindromische Sequenzen mit einer Länge von 10 Nukleotiden gefunden, die als mögliche Operatoren fungieren (OP1, OP2). Es wurden für die Aktivitätsmessung mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) verschiedene Deletionsplasmide erstellt. Nach Ergebnissen der HPLC ergaben sich Hinweise auf die Beteiligung von OP1 als Operator und einem von orf 4 codierten Repressorprotein. Mit Hilfe von Elecrophoretic mobility shift assays (EMSA) konnte gezeigt werden, dass an beide palindromische Sequenzen OP1 und OP2 eine spezifische Proteinbindung erfolgte und die Sequenzen als Operatoren der 3α-HSD wirken. Die zwei Operatorsequenzen befinden sich in einem Abstand von 1.633 kb. Es besteht die Vermutung, dass OP1 und OP2 einen DNA-Loop ausbilden und so zur effizienteren Repression zusammentreten. Dieser Mechanismus ist bei vielen Bakterien zu finden. Es konnte auch eine Bindung an benachbarte Sequenzen der Operatoren gefunden werden. Das gibt den Hinweis auf ein größeres Repressorprotein, da OP1 und OP2 nur jeweils 10 bp umfassen. Wie schon in der HPLC gesehen wurde, konnte mit Hilfe von EMSA eine spezifische Bindung eines von orf 4 codierten Proteins an die Operatoren der 3α-HSD nachgewiesen werden. Die Sequenz dieses Repressorproteins (Repressor A) umfasst eine Länge von 1.263 kb. Sie codiert 420 Aminosäuren, das entspricht einem Molekulargewicht von 45.4 kDa. Für zwei weitere offene Leserahmen (orf 2, orf 3) konnte eine Bindung an chromosomale DNA von C. testosteroni ausgeschlossen werden. In anderen in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. E. Maser durchgeführten Arbeiten konnte ein Repressorprotein ausgehend von orf 2 gefunden werden, das seine repressorische Aktivität auf mRNA-Ebene entfaltet (Xiong et al., 2003). In weiterführenden Experimenten wurden die Repressorproteine mit Hilfe von His-tag-Säulen gereinigt und Antikörper präpariert. Als nächster Schritt ist der spezifische Bindungsnachweis von Repressor A an OP1 und OP2 mittels Footprint-Analysen geplant. Durch die Aufdeckung und das Verständnis der regulatorischen Elemente des steroidmetabolisierenden Enzyms 3α-HSD/ CR in C. testosteroni im Rahmen des steroidalen Abbauwegs lassen sich therapeutische Konsequenzen für Medizin und Ökologie ableiten. Zum einen könnten steroidinduzierbare Organismen gezielt gentechnisch generiert und appliziert werden, um bei Patienten mit Hypercholesterinämie einen der Hauptrisikofaktoren für Herz-Kreislauferkrankungen intestinal zu senken. Ein anderes Betätigungsfeld läge in der in situ-Reinigung kontaminierter Umwelt, z.B. der durch Steroide feminisierten Flussfauna. Aber auch der Abbau von langlebigen polychlorierten Biphenylen könnte durch den Einsatz von C. testosteroni forciert werden.