Az Escherichia coli mutációs folyamatai: analízis, átalakítás, alkalmazás = Mechanisms of mutation in Escherichia coli: analysis, engineering and applications

摘要

A mutáció, azaz a DNS átörökíthető jellegű megváltozása nem csak emberben, de baktériumban is fontos jelenség, mind egészségügyi, mind biotechnológiai vonzata miatt. Az Escherichia coli baktérium mutációs gyakoriságát már korábban csökkentettük azáltal, hogy eltávolítottuk belőle az összes mobilis genetikai elemet, azaz „ugráló gént” (IS elemet, profágot, transzpozont). A jelen munkában bizonyítottuk, hogy az így kapott IS-mentes redukált coli törzs alkalmasabb olyan fehérjék túltermelésére, amelyeket egyébként a mobilis elemek túl gyakran inaktiválnának. Azért, hogy az IS-mentes coli törzset a törzs-szerkesztés során gyakran használt fág-transzdukció se szennyezhesse vissza IS elemekkel, létrehoztunk egy garantáltan IS-mentes P1 bakteriofágot. Az E. coli mutációs repertoárja további szűkítésének céljából eltávolítottuk az ún. „sokat hibázó” DNS polimerázok génjeit is. Ezzel a változtatással nagy részben kivédhetővé vált a baktériumokra stresszhelyzetek során jellemző mutációs gyakoriság-emelkedés is. Végül kifejlesztettünk egy módszert, amellyel mérhető, hogy egy IS-mentes törzshöz képest mekkora szelekciós előnnyel bír egy egyetlen kópia IS elemet tartalmazó baktérium. E rendszer segítségével újrajátszottuk azt az evolúciós folyamatot, mely során az első IS elemek elterjednek az enterobaktériumok genomjában, és megállapítottuk, hogy az IS elemek elterjedéséért azok „önző”, replikatív jellege, és nem az általuk okozott szelekciós előny tehető felelőssé. | Spontaneous mutations arising in prokaryotes are the basis of several problematic phenomena, e.g. antibiotic resistance of pathogens or reduced production yield of various industrially useful bacterial strains. We have previously narrowed the mutational repertoire of Escherichia coli by removal of all mobile DNA elements (IS elements, prophages, transposons) in a large scale genome-reduction effort. In this work, we demonstrate that the lack of transposable elements aids the cloning and expression of a foreign protein, which is otherwise rapidly inactivated by ISes disrupting its gene with a high frequency. To prevent recontamination of the IS-free bacterial genome by transposable elements during generalized phage transduction, we have removed the resident IS1 element from the genome of phage P1vir, commonly used for strain engineering. We further decreased the mutation-generating potential of E. coli by removal of the genes of three error-prone DNA polymerases, thereby significantly reducing the rate of point mutations. In addition, we have developed a method to measure the selective advantage conferred by a single IS element residing in the bacterial genome, compared to an IS-free host. We used this technique to “replay evolution”, and demonstrate that the invasion of enterobacterial genomes by IS-elements in evolutionary history was most probably fueled by the selfish (replicative) nature of the elements, and not by the selective advantage they conferred to their hosts.