A poli(ADP-riboz)polimeráz biológiai szerepének vizsgálata. Az enzim fehérje-fehérje kölcsönhatásainak, valamint DNS kötésének szerepe az enzimaktivitás és a biológiai funkció regulációjában. = On the biological role of poly(ADP-riboze)polymerase. The effect of protein-protein interactions and the PARP binding to DNA in the regulation of enzimyc activity and biological function of the enzyme

摘要

A PARP-1 enzimmüködés további jellemzéséhez csonkított és egy-pont mutánsokat terveztünk és a rekombináns fehérjéket előállítottuk a bakulovírus rendszer használatával.. Az egy vagy mindkét Zn ujj hiányos mutánsok enzimaktivitása dramatikusan csökkent. A továbbiakban az un. Cterminális PARP moleklát vizsgáltuk részletesebben, ahol mindkét Zn ujj hiányzik. Kimutattuk, hogy az enzim aktiválható DNS-sel vagy DNS szerkezetekkel, képes auto és transz ADP-ribozilálásra. Míg a Km értékek hasonlóak a vad típusú enziméhez a Vmax érték annak egy tizede. Az ATP-nek a PARP-1 enzimre való gátló hatását vizsgáltuk. Abból a megfigyelésből,hogy az R34G mutáns az ATP effektust nem mutatja arra jutottunk, hogy az első Zn-ujjon lehet az ATP támadáspontja. Másrészt kimutattam, hogy a poliADP-ribóz polimert lebontó PARG enzim aktivitását az ATP fokozza. Mindkét effektust kimutattuk úgy izolált sejtmagok, mint permeabilizált sejtek használatával is. A PARP-1 sejtes aktivitását meghatároztuk az un. fiziológiás PARP assay segítségével, a PARP, a PAR módosított fehérjék mennyiségének 1D ill 2D Western blot-os elemzésével úgy log fázisban növekedő mint konfluens primer tüdő sejtekben, valamint gyorsan növő tumor sejtekben, Ernest Kun laborjával kooperálva. A PARP aktivitások nagy különbségeket mutatnak, a konfluens primer sejteké a legalacsonyabb, míg jelentősen magasabb a növekedő primer ill. a tumor sejtekben. Ugyancsak 5-10 szeres PARP aktivitás növekedést tapasztaltunk két differenciálódási modellben (myocite/myotube és 3T3LI fibroblaszt/adipocta), míg ezt nem tapasztaltuk a HL60/granulocita átalakulás során. | To further characterize the enzymic activity of PARP-1, truncated and point mutants of the enzyme were designed and the recombinant molecules expressed in baculovirus system. The Zn-finger truncated mutants loose most of their enzyme activities. The C-terminus PARP mutant where both Zn-fingers are missing was further characterized. The enzyme can be activated by DNA, recognizes DNA structures and shows auto and trans ADP-ribosylating activities. While the Km values are comparable to that of the wild type enzyme, the Vmax values are an order of magnitude lower. The inhibitory effect of ATP on the PARP-1 enzyme was characterized. From the observation that the R34G mutant does not show the ATP effect we surmised that the ATP effect is manifested through the first Zn-finger. On the other hand ATP activates the ADP-ribose degrading activity of purified PARG enzyme. Both effects has been confirmed when isolated cell nuclei or lysolechitine permeabilized cells were used as source of PARP-1. The cellular activities of PARP-1 was analyzed by the "physiological" PARP-1 assay and by 2D Western blots in rapidly growing and confluent primary lung cells and in Eras tumor cells in cooperation with Ernest Kun's lab. The amount of PARP-1 protein, its enzymic activity and the modified protein distribution showed vast differences.The largest PARP activitie were observed in growing primary and tumor cells. We have also observed 5-10 fold increases in PARP activities in two differentiation modells (myocite/myotubes or 3T3Li fibroblast/adipocyte conversions) but not int he HL60/granulocyte modell.