A pseudoxanthoma elasticum öröklődő betegség kialakulásáért felelős ABCC6/MRP6 gén transzkripciós szabályozásának vizsgálata = Transcriptional regulation of the pseudoxanthoma elasticum (PXE) causing ABCC6/MRP6 gene

摘要

Kísérleteimben a pseudoxanthoma elasticum öröklődő betegség kialakulásáért felelős ABCC6 gén transzkripciós szabályozását vizsgáltam és az ehhez szükséges metodikákat állítottam be és fejlesztettem tovább. Kimutattam, hogy: - a génnek 3, az evolúció során erősen konzervált nem kódoló régiója van; - a proximális promóter konzervált régió metilációja szövetspecifikus és inverz korrelációt mutat a gén kifejeződésével; - a promóterben egy aktivátor és egy represszor szekvencia található; - az aktivátor szekvencia DNS metilációra érzékeny. Beállítottam a biszulfitos genomszekvenálást, a DNáz hiperszenzibilitási esszét, illetve a gén kifejeződésének mérésére a kvantitatív PCR-t. Kifejlesztettünk egy primer-tervező és analizáló programot, mely különösen a DNS metiláció meghatározásához használatos biszulfitos genomszekvenáláshoz nyújt segítséget. A kvantitatív PCR beállítása során kialakítottunk egy általános érvénnyel alkalmazható új típusú normalizálási eljárást. Munkánk eredménye egy webszerver, öt közlemény és egy könyvfejezet. Azonosítottuk továbbá a gén 3 DNáz hiperszenzitív helyét és teszteltük számos vegyület hatását a gén kifejeződésére. Közülük többnek is kimutattuk a gátló hatását. Kísérleteink újabb iránya a gén pszeudogénjeinek kialakulását vizsgálja. Eredményeink szerint a pszeudogének non- allelikus homológ rekombinációval jöttek létre. Jelenlétük következménye pl betegségokozó mutációk kialakulása génkonverziós mechanizmussal. Kéziratunkat benyújtottuk közlésre. | The transcriptional regulation of ABCC6, the disease gene of pseudoxanthoma elasticum was investigated in the present study. I also set up and developed the techniques necessary for this work. I demonstrated: The existence of 3 evolutionarily conserved non-coding regions in the gene; The inverse correlation between the tissue-specific methylation of the proximal promoter and ABCC6 expression; The presence of an activator and a repressor in the proximal promoter; The DNA methylation dependence of the activator sequence. I set up the bisulfite genomic sequencing technique, the DNase hypersensitivity and quantitative PCR assays. We developed a primer-design and analyzer software, particularly useful in bisulfite genomic sequencing assays. We developed a novel universally applicable normalization technique for quantitative PCR. As a result of the 3-year period we developed a successful web server, published five papers, one book chapter and initiated one patenting process. We have also identified three hypersensitive sites and screened a number of molecules for their activity on the expression level of the gene. Several tested molecules had a specific inhibitory effect on ABCC6 expression Recently we studied the appearance of ABCC6 pseudogenes. Our data suggest their creation by non-allelic homologous recombination. The consequence of their presence is e.g. the development of disease-causing mutations by gene conversion events. Our manuscript describing the phenomenon is submitted.