A protein foszfatáz Z szerepének felderítése a patogén gombák jelátviteli folyamataiban = Investigation of the function of protein phosphatase Z in the signal transduction of pathogenic fungi

摘要

A protein foszfatáz Z C. albicans ortológját kódoló gén, a CaPPZ1 klónozása és szekvenálása segítségével alátámasztottuk a humán patogén nagyfokú genetikai polimorfizmusát. Legalább 4 CaPPZ1 allélt azonosítottunk, és egy találtunk egy olyan hipervariábilis gén régiót, ami alkalmasnak bizonyult klinikai C. albicans izolátumok genotipizálása. In vitro mutagenézissel azonosítottuk a foszfatáz enzim aktivitását, illetve stabilitását biztosító aminosav oldalláncokat. Molekuláris genetikai módszerekkel bebizonyítottuk, hogy a CaPPZ1 szerepet játszik a gomba kation homeosztázisában, sejtfal bioszintézisében és membrán potenciáljának meghatározásában, valamint fontos a hifa növekedésben, és a patogén gomba fertőzőképességében. Megállapítottuk, hogy az A. fumigatus és az A. nidulans PPZ ortológok szerkezete konzerválódott, és a phzA, illetve a ppzA géntermékekről igazoltuk, hogy funkcionálisan helyettesítik a hiányzó PPZ enzimeket S. cerevisiae és S. pombe mutánsokban. Ennek ellenére a ppzA gén inaktiválása nem járt a várt fenotípusok változásokkal A. nidulansban, viszont érzékenységet okozott oxidálószer kezeléssel szemben. A genetikailag távol álló C. albicans és S. cerevisiae PPZ mutánsokkal történő összehasonlítás alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az PPZ enzimek részt vesznek a gombák oxidatív stressz válaszának modulálásában. Ily módon egy régóta ismert foszfatáz új funkcióját sikerült azonosítanunk. | By cloning and sequencing of the protein phosphatase Z (PPZ) coding CaPPZ1 gene we confirmed the high level of genetic polymorphism of the human pathogen C. albicans. We identified four different alleles of the gene and found a hypervariable DNA segment that was suitable for genotyping of clinical C. albicans isolates. With in vitro mutagenesis we pinpointed the amino acid residues that are important in the activity / stability of the phosphatase. With the aid of molecular genetics we revealed that CaPPZ1 was important in the cation homeostasis, cell wall integrity and membrane potential determination of the fungus. In addition to these general PPZ roles, we also found that CaPPZ1 was involved in the germ tube formation and in the virulence of the pathogen. By extending these results we predicted that the structures of the PPZ ortholog proteins were well conserved in A. fumigatus and A. nidulans, and demonstrated that the corresponding phzA and ppzA phosphatases behaved as the functional replacements of the yeast enzymes in S. cerevisiae and S. pombe deletion mutants. However, the inactivation of the PPZA gene did not result in the expected phenotypes in A. nidulans, but caused sensitivity to oxidative agents. By the comparison with the genetically distantly related C. albicans and S. cereveisiae PPZ mutants we proved that all of these PPZ phosphatases acted in the oxidative stress mediation of fungi. Thus, we identified a novel function for a long known enzyme family.