Microarray-based detection of antibiotic resistance and virulence factor genes in Salmonella spp. isolated from food-producing animals and processed food

摘要

Salmonella enterica é uma bactéria patogénica de origem alimentar que infecta seres humanos pelo mundo inteiro. Nalguns casos, as infeções por Salmonella requerem tratamento com antibióticos. A resistência a agentes antimicrobianos é um problema global e leva ao insucesso do tratamento de infeções bacterianas. Alguns estudos têm sido realizados em Portugal na resistência a antimicrobianos e metais pesados em Salmonella de origem animal e alimentar. E poucos estudos de virulência têm sido efetuados até ao momento em Portugal. Este trabalho teve assim como objetivo o estudo fenotípico e genotípico de genes de resistência a antibióticos e metais pesados. Por outro lado, um novo DNA microarray foi desenhado e validado para avaliar a virulência de isolados de Salmonella spp. recolhidos de animais e alimentos de origem animal. Um total de 14 serótipos foi identificado, dos 258 isolados recolhidos, sendo S. Typhimurium (32.6%) e S. Enteritidis (10.1%) os mais comuns. A maioria dos isolados (70.2%) era resistente a pelo menos uma classe de antibióticos, apresentando uma maior frequência de resistência à tetraciclina (47.7%) e ampicilina (36.0%). A resistência às fluoroquinolonas foi verificada em 8% dos isolados. S. Enteritidis possuía ESBL blaSHV-12 num plasmídeo conjugativo IncI. Um subgrupo de 106 isolados de S. enterica foi selecionado, que incluía S. Typhimurium, S. Enteritidis, e outros isolados resistentes a antibióticos pertencentes a serótipos menos comuns. O perfil genético de resistência a antibióticos foi efetuado com recurso a microarrays para genes de resistência a antibióticos. Verificou-se que 65.1% destes isolados apresentavam resistência à tetraciclina conferida por tet(B), e 58.8% à ampicilina, principalmente devido à presença de blaTEM-type e blaPSE-type. A resistência a metais pesados foi detetada pela sequenciação completa do genoma, e estudos fenotípicos e sua capacidade de disseminação foi feita por conjugação com Escherichia coli. Um isolado multirresistente S. Typhimurium Sal25, apresentava resistência aos metais pesados, e assim como a presença da ESBL blaCTX-M-1 num plasmídeo conjugativo IncHI2, plasmídeo esse que possuía vários genes de resistência a metais pesados como telurite, zinco, cobre, cobalto, arsénio, mercúrio, prata e cádmio. Este trabalho descreveu pela primeira vez S. Typhimurium com blaCTX-M-1 em Portugal. A estirpe S. Typhimurium Sal368 mostrou também pela primeira vez em Salmonella, a presença do gene tet(M) inserido na transposase Tn3 num plasmídeo IncF que também albergava os genes de resistência a arsénio, mercúrio e prata. Os plasmídeos IncHI2 e IncF foram facilmente transferidos por conjugação para E. coli. Nos estudos de virulência, os mesmos 106 isolados foram estudados. Genes das ilhas de patogenicidade (SPI) e genes de adesão muito conservados enquanto genes de profágos e plasmídeos de virulência eram variáveis. Resultados atípicos de microarrays levaram à sequenciação do genoma do isolado S. Infantis Sal147, onde se identificou a deleção de 35 genes da SPI-1. Ensaios de adesão/invasão foram efetuados em células de cólon humano, HT-29, e o isolado mostrou capacidade para aderir mas não para entrar nas células HT-29. Estudos subsequentes efetuados in vivo em larvas de Galleria mellonella demonstraram reduzida capacidade de mortalidade em comparação com uma estirpe de S. Infantis com SPI-1 completa. A análise de microarray e da sequenciação do genoma de S. Typhimurium Sal199 demonstrou pela primeira vez a presença do gene cdtB e outros genes relacionados com S. Typhi, em S. Typhimurium. A caracterização de Sal199 mostrou a localização a montante de uma transposase IS911 e a co-expressão de outros genes relacionados com S. Typhi. Em células HeLa infetadas com Sal199, verificou-se paragem de divisão celular, distensão do citoplasma, e enlargamento do núcleo, resultados não observados aquando da infeção pelas células com controlo S. Typhimurium LT2. Estudos in vivo mostraram um aumento na mortalidade de G. mellonella infetadas com Sal199 em comparação com LT2. Em conclusão, este estudo permitiu uma primeira abordagem a Salmonella que podem infetar seres humanos. Em caso de infeção o tratamento poderia ser ineficaz, e as infeções por Salmonella poderiam ser mais severas. A identificação de estirpes com grande potencial de virulência em alimentos numa fase inicial facilita a intervenção precoce reduzindo o risco de disseminação de estirpes epidémicas. Assim, métodos como DNA microarrays e sequenciação completa do genoma podem ser usados em análises epidemiológicas e surtos de Salmonella. Assim, o uso de métodos de rastreamento de resistência a antibióticos e virulência podem ajudar a perceber os potenciais riscos associados a infeção de humanos por Salmonella.