Entwicklung einer Methode der zufälligen Domänenkombination zur Optimierung von Peptidoglykan-Hydrolasen für die Anwendung im Lebensmittel am Beispiel von Listeria spp. mit anschließender Charakterisierung ausgewählter Proteine

摘要

Endolysine degradieren das Peptidoglykan, wodurch die Bakterienzelle osmotisch destabilisiert wird und birst. Diese Enzyme sind äußerst spezifisch für bestimmte Bakterienarten und -gattungen, weshalb sie ein großes Potential für die gerichtete Eindämmung von Infektionskrankheiten darstellen und auf der Suche nach Lösungen für eine natürliche und gezielte Bekämpfung von pathogenen Bakterien zunehmend an Interesse gewinnen.udEndolysine sind modular aufgebaut, so dass sich die Funktionen der Zellbindung und der Hydrolyse distinkten Domänen zuweisen lassen. Durch die Bildung von Chimären können neue Moleküle mit veränderten Eigenschaften generiert werden. Somit lassen sich beispielsweise Substratspezifität, Lyseeffizienz, geringe Proteinstabilität oder die Aktivität in Gegenwart von interferierenden Substanzen verändern. Das Prinzip wird genutzt, um diese Proteine je nach gewünschten Eigenschaften für eine Anwendung zu modifizieren. Chimärenbildung erfolgte bisher über den aufwendigen rationalen Ansatz, einzelne Proteine zu entwerfen, zu klonieren und zu testen, wobei eine Vielzahl der Konstrukte nicht den Anforderungen entsprach. udIm Zuge dieser Arbeit sollte daher ein neuer Ansatz verfolgt werden, nämlich der zufälligen Kombination von Domänen aus Zellwand-Hydrolasen mit anschließendem Screening auf gewünschte Eigenschaften, so dass gezielt geeignete Moleküle identifiziert werden können. Dies erfolgte am Beispiel von Lysinen gegen Listeria. Listeria monocytogenes ist ein ernstzunehmender Lebensmittelpathogen, der durch seine Fähigkeit, in vakuumverpackten und gekühlten Lebensmitteln zu wachsen, nur schwer kontrollierbar ist. Der Zusatz eines listerienspezifischen Enzyms würde Kommensale und Nutzbakterien schonen und durch Eliminierung oder Inhibition des Krankheitserregers die Sicherheit von Lebensmitteln erhöhen. udDie angestrebte Strategie sah vor, verschiedene Domänen aus Zellwand-Hydrolasen zufällig miteinander zu Proteinen mit 2 und 3 Domänen zu kombinieren, wobei jede Domäne für jede mögliche Position zugelassen wird.udHierfür wurde zunächst eine Klonierungsmethode entworfen und erfolgreich umgesetzt. Diese Methode umfasst eine zeitsparende Probenvorbereitung für die Erstellung positionsspezifischer DNA-Fragmente mit anschließender zufälliger Ligation an der Festphase. udEs wurden 2- und 3-Domänen Proteine generiert unter der Verwendung von 6 Zellbindedomänen aus Listerien-Endolysinen und 12 enzymatisch aktiven Domänen aus Endolysinen, Autolysinen, einem Bakteriozin und einem lytischen Phagenschwanzprotein mit verschiedenen Spezifitäten und Domänenmotiven. udMehr als 1057 Varianten mit 2 Domänen und 15497 Varianten mit 3 Domänen wurden analysiert. Im initialen Schritt wurde generell auf Funktionsfähigkeit gegen ein Listerien-Serovar gescreent. Die anschließenden Testungen verfolgten das Ziel der späteren Anwendung im Lebensmittel, weshalb neben breiter Serovarspezifitiät auch auf Aktivität bei saurem pH, Toleranz von EDTA sowie Wachstumsinhibition von Listerien getestet wurde. Fünf selektierte chimäre Proteine wurden gereinigt und zusammen mit den Wildtyp-Endolysinen Ply511, PlyP40 und PlyP825 auf chemische, proteolytische und Temperatur-Stabilität, pH- und Salz-Optima, den Einfluss von EDTA auf die Enzymaktivität sowie minimale inhibitorische Konzentration und minimale bakterizide Konzentration untersucht. Als Beispiel für die Anwendung in einer sehr komplexen Lebensmittelmatrix wurde zudem die bakterizide Wirkung in Milch getestet.udDas beste gescreente Molekül war EcoGU3, eine Chimäre aus 3 Domänen, nämlich zwei enzymatischen aktiven Domänen mit verschiedenen Spezifitäten und einer mittigen Zellbindedomäne. EcoGU3 zeigte deutlich höhere Zellzahlreduktion in der Testung der minimalen bakteriziden Konzentration im Vergleich zu den untersuchten Wildtyp-Proteinen. udIn zukünftigen Arbeiten soll dieses Protein für die Anwendung in einer komplexen Lebensmittelmatrix optimiert werden.